溫度和光照強(qiáng)度對(duì)多肋藻(Costaria costata)配子體生長(zhǎng)影響研究

孫 娟，潘金華，張壯志，李 霞，趙 楠，梁廣津，史 良，姜黎明，曲艷艷，羅世菊，李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003)

多肋藻(Costariacostata)是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型褐藻，屬于海帶目(Laminariales)、海帶科(Laminariaceae)，是多肋藻屬(Costaria)中唯一的一個(gè)種[1]。多肋藻自然資源主要分布在北太平洋沿岸潮間帶或者潮下帶淺海區(qū)域，其中朝鮮半島東北沿海、日本北海道及本土、俄羅斯遠(yuǎn)東的鄂霍次克海、大彼得灣均有分布[2-5]。多肋藻藻體葉片具有5條縱向分布的“肋”，在日本被稱為“筋布”，富含碘和多種人體必需微量元素，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和悠久的食用歷史[1，6]。由學(xué)策等[7]在室溫條件下跟蹤觀測(cè)了多肋藻配子體生長(zhǎng)狀況以及孢子體育苗后幼苗生長(zhǎng)情況，為室溫條件下多肋藻育苗提供了重要參考；Fu等[8]和梁廣津等[9]分別采用孢子體育苗和配子體育苗技術(shù)完成多肋藻育苗并進(jìn)行海區(qū)栽培試驗(yàn)，藻體長(zhǎng)度分別達(dá)到194.0和228.3 cm。李苗苗等[10]提取了多肋藻多糖并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，表明多肋藻中多糖主要為褐藻膠和2種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的褐藻糖膠，是一種多糖含量豐富的優(yōu)良藻種。李鷥鷥等[11]優(yōu)化了多肋藻巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝并對(duì)其降血脂作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示多肋藻巖藻聚糖硫酸酯粗提物對(duì)小鼠血清總膽固醇、血清甘油三酯和低密度脂蛋白均具有顯著的抑制作用。多肋藻作為一種優(yōu)良的大型經(jīng)濟(jì)褐藻，其商業(yè)化開(kāi)發(fā)利用具有重要的價(jià)值和意義，開(kāi)發(fā)其配子體快速擴(kuò)增培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)采用配子體進(jìn)行多肋藻苗種繁育，提高苗種繁育效率并對(duì)多肋藻大規(guī)模產(chǎn)業(yè)栽培和開(kāi)發(fā)也具有重要的支撐作用。本文以多肋藻配子體為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)定不同溫度和光照強(qiáng)度條件研究多肋藻配子體適宜生長(zhǎng)條件，以期為多肋藻配子體規(guī)模化擴(kuò)增培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中采用的多肋藻配子體，取自國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心種質(zhì)庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)方法

將多肋藻雌、雄配子體磨碎，分裝進(jìn)入培養(yǎng)皿內(nèi)(φ 9 cm)，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱(10℃和1 000 lx)進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)1周，然后將恢復(fù)培養(yǎng)之后裝有多肋藻配子體的培養(yǎng)皿分別轉(zhuǎn)入溫度8、12、15、20、23℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)，每個(gè)溫度條件下設(shè)置500、1 000、2 000、3 000、4 000 lx共5個(gè)光照強(qiáng)度條件。雌、雄配子體分別進(jìn)行相同溫度和光照條件的試驗(yàn)。每周鏡檢配子體狀態(tài)，經(jīng)過(guò)4周培養(yǎng)之后，拍照(Olympus IX51)，并采用Image-pro進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。每個(gè)試驗(yàn)條件設(shè)3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿測(cè)量10個(gè)數(shù)據(jù)，即每個(gè)試驗(yàn)條件共測(cè)量30個(gè)數(shù)據(jù)(n=30)。根據(jù)初始配子體平均長(zhǎng)度(L0)和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的配子體平均總長(zhǎng)度(L1)計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)速率(RGR，%·d-1)，計(jì)算公式RGR=100·[ln(L1)-ln(L0)]/t，其中t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用雙因素方差分析檢驗(yàn)溫度和光照條件對(duì)多肋藻配子體生長(zhǎng)的影響，相同溫度條件下進(jìn)行單因素方差分析并采用LSD進(jìn)行差異顯著性分析。Leven’s-test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化。顯著水平設(shè)為P<0.05。所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 17.0軟件內(nèi)完成。

2 結(jié)果

2.1 溫度8℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長(zhǎng)情況

在8℃條件下，只有當(dāng)光照強(qiáng)度為500 lx時(shí)，多肋藻雌配子體才生長(zhǎng)，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長(zhǎng)度由81.27 μm生長(zhǎng)至214.72 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約3.05%；在所設(shè)置的其它光照強(qiáng)度下幾乎全部萎縮、衰亡，無(wú)法正常存活。而雄配子體在500 lx生長(zhǎng)最快，配子體平均總長(zhǎng)度由77.63 μm生長(zhǎng)至6 022.80 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約14.42%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖1和圖2)。

2.2 溫度12℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長(zhǎng)情況

在12℃條件下，多肋藻雌配子體在1 000 lx時(shí)生長(zhǎng)最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長(zhǎng)度由81.27 μm生長(zhǎng)至1 040.33 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約8.73%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在500 lx生長(zhǎng)最快，配子體平均總長(zhǎng)度由77.63 μm生長(zhǎng)至3 387.07 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約12.97%，生長(zhǎng)速度與1 000 lx試驗(yàn)組差異不顯著，但顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖3和圖4)。

2.3 溫度15℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長(zhǎng)情況

在15℃條件下，多肋藻雌配子體在500 lx時(shí)生長(zhǎng)最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長(zhǎng)度由81.27 μm生長(zhǎng)至8 813.40 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約16.04%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在2 000 lx生長(zhǎng)最快，配子體平均總長(zhǎng)度由77.63 μm生長(zhǎng)至8 322.13 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約16.10%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖5和圖6)。

2.4 溫度20℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長(zhǎng)情況

在20℃條件下，多肋藻雌配子體在1 000 lx時(shí)生長(zhǎng)最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長(zhǎng)度由81.27 μm生長(zhǎng)至10 234.07 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約16.58%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在2 000 lx生長(zhǎng)最快，配子體平均總長(zhǎng)度由77.63 μm生長(zhǎng)至17 215.33 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約18.54%，生長(zhǎng)速度與1 000 lx試驗(yàn)組差異不顯著，但顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖7和圖8)。

2.5 溫度23℃條件下多肋藻雌、雄配子體生長(zhǎng)情況

在23℃條件下，多肋藻雌配子體在1 000 lx時(shí)生長(zhǎng)最快，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，配子體平均總長(zhǎng)度由81.27 μm生長(zhǎng)至7 865.67 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約15.82%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)。而雄配子體在2 000 lx生長(zhǎng)最快，配子體平均總長(zhǎng)度由77.63 μm生長(zhǎng)至15 206.83 μm，相對(duì)生長(zhǎng)速率約18.20%，生長(zhǎng)速度顯著大于其他光照組(P<0.05)(圖9和圖10)。

3 討論

20世紀(jì)70年代我國(guó)海藻遺傳學(xué)家方宗熙發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)條件下海帶雌、雄配子體均可形成無(wú)性繁殖系(又稱克隆系)并可以單獨(dú)培養(yǎng)[12]，隨后海帶配子體低溫、弱光保存培養(yǎng)技術(shù)獲得突破，直到目前其仍為大規(guī)模種質(zhì)保存的常用技術(shù)[13]，此后又先后開(kāi)發(fā)了固相保存技術(shù)[14]和超低溫冷凍保存技術(shù)[15]，海帶配子體無(wú)性繁殖系逐步被廣泛用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究以及海帶雜交育種[16-17]。曾呈奎等[18]最早研究了培養(yǎng)溫度對(duì)海帶配子體生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)15℃和10℃分別是海帶配子體適宜生長(zhǎng)和適宜發(fā)育的溫度條件，李曉捷等[19]對(duì)901海帶配子體的研究也得出相似結(jié)論，并且發(fā)現(xiàn)25℃是致死溫度。本研究結(jié)果顯示，在各試驗(yàn)溫度條件下，多肋藻雄配子體生長(zhǎng)速度要顯著快于雌配子體，且隨著培養(yǎng)溫度升高，雄配子體的適應(yīng)生長(zhǎng)光照強(qiáng)度也顯著高于雌配子體；多肋藻雌、雄配子體均在溫度20℃條件下生長(zhǎng)速度最快，這與王軍等[20]對(duì)利尻海帶配子體的研究得出的結(jié)論相似。

本文研究發(fā)現(xiàn)在8℃條件下，雌配子僅在500 lx下能夠正常存活，但生長(zhǎng)異常緩慢，而雄配子體則明顯比雌配子體生長(zhǎng)速度更快，且所有試驗(yàn)條件下均能存活，在其他溫度條件下，相同光照強(qiáng)度條件下的雄配子體生長(zhǎng)速度也大多快于雌配子體，證明多肋藻雄配子體抗逆性和適應(yīng)性要顯著強(qiáng)于雌配子體。在23℃條件下，多肋藻雌、雄配子體生長(zhǎng)速度均出現(xiàn)明顯下降，且發(fā)生配子體萎縮衰亡。培養(yǎng)溫度是影響海帶配子體生理指標(biāo)的重要環(huán)境因素，高溫處理對(duì)海帶配子體存活率有顯著影響，且存在配子體性別差異和品種差異，奔牛配子體在23℃進(jìn)行不同時(shí)間的脅迫處理，結(jié)果顯示處理4 d后配子體存活率僅為40%左右[21]。宣慧等[22]研究發(fā)現(xiàn)在20℃條件下，海帶配子體的生長(zhǎng)和各項(xiàng)生理指標(biāo)與對(duì)照組15℃相比無(wú)明顯變化，但在25℃條件下培養(yǎng)1 d后，葉綠素a含量逐漸下降；而在28℃和30℃條件下培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞色素萎縮分解并隨后大量死亡。因此，多肋藻配子體的培養(yǎng)溫度應(yīng)該嚴(yán)格控制在23℃以下，最好能保持在20℃以內(nèi)。對(duì)于雌性配子體培養(yǎng)，光照強(qiáng)度保持在1 000 lx左右為宜；雄性配子體培養(yǎng)，光照強(qiáng)度保持在2 000 lx左右為宜。