石莼多糖部分降解工藝優化

許雅楠，呂 峰，李燕妹

(福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

隨著對多糖構-效關系研究的不斷深入，發現對天然多糖進行分子修飾及結構改造有助于改善其生物活性[1]。針對多糖分子的修飾主要采用包括基團修飾(硫酸化、甲基化)、部分降解修飾等方法。天然多糖的分子量大小與其生物活性密切相關。通常，一定程度地降低多糖分子量可提高其生物活性及利用率[2-3]，并可滿足醫藥[4]、食品[5]等領域的應用要求；但當多糖分子量過低時，其活性聚合結構無法形成[6]，生物活性反而下降[7-8]。因此本研究選擇50%為目標降解率，既保證天然多糖分子量有效降低，又避免無價值小分子糖的大量生成。

本研究采用稀硫酸降解法，對石莼多糖進行部分降解，以50%為目標降解率，分別探討了硫酸溶液濃度、降解溫度、多糖濃度與降解時間對石莼多糖降解率的影響，并采用三因素三水平響應面分析法對石莼多糖部分降解工藝進行優化，以期為天然石莼多糖綜合開發與深加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 石莼多糖制備材料與試劑

稱取一定質量石莼干粉，加入30倍質量蒸餾水，調節溶液pH值為4.8；按400 U/g石莼干粉添加經活化的纖維素酶，于45℃下恒溫提取90 min，滅酶、離心，收集上清液，真空濃縮；加入4倍體積的95%乙醇，冷藏過夜，離心、收集乙醇沉淀物，加水復溶，真空濃縮，冷凍干燥，得石莼多糖粗品(多糖含量為35.62%)。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；RE52-99型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；DL-5-B離心機：上海安亭科學儀器廠；JB-90-2磁力攪拌器：上海天平儀器廠。

1.3 試驗內容與方法

1.3.1 石莼多糖部分降解工藝流程

稱取石莼多糖，加入預熱的稀硫酸溶液，恒溫酸解，冰浴冷卻，4 000 rpm離心5 min，取上清液，調pH至中性，定容，測定其總糖、還原糖含量，樣液于500 Da透析袋中流水透析48.0 h， 真空濃縮(0.95 MPa，45℃)使其體積約為原體積的5%，最后冷凍干燥，收集降解樣品。

1.3.2 評價指標

張競男[9]論證了以“還原糖的相對含量”作為多糖降解程度考察指標的可行性，故本試驗采用還原糖相對含量(記為降解率)為衡量指標，計算方法如公式(1)。

(1)

式中，A：待測樣液的總糖含量；A0：待測樣液的還原糖初始含量；A1：待測樣液降解后的還原糖含量。

還原糖含量采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)法測定；總糖含量采用硫酸-苯酚法測定。

1.3.3 單因素試驗設計

以硫酸溶液濃度(0.05、0.10、0.30、0.50、0.70 mol/L)、降解溫度(60、70、80、90、100℃)、多糖濃度(1、5、10、15、20 mg/mL)、降解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)4個因素進行單因素試驗，研究各因素對石莼多糖降解效果的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以硫酸溶液濃度(X1)、降解溫度(X2)、多糖濃度(X3)為自變量，石莼多糖降解率(Y1)為響應值，采用三因素三水平響應面分析法，對石莼多糖樣品的部分降解關鍵工藝條件進行優化，試驗因素與水平表如表1。

表1 Design Expert試驗因素與水平表

1.3.5 統計分析

試驗數據采用DPS v7.05進行方差分析，各數據間多重比較采用Duncan新復極差法，Microsoft Excel 2007軟件繪圖。顯著性界值以P>0.05為不顯著，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。采用Design Expert v 8.0對優化試驗數據進行響應面分析，并對各因素回歸擬合。

2 結果與分析

2.1 硫酸溶液濃度對石莼多糖降解率的影響

在酸性條件下，H+與多糖分子上O原子的結合，使多糖的分子鏈變得極不穩定，導致糖苷鍵斷裂，從而達到降解多糖的效果[10]。如圖1所示，在本研究所設的硫酸溶液濃度范圍內，石莼多糖樣品的降解率均隨硫酸溶液濃度的增大而極顯著(P<0.01)提高。當硫酸溶液濃度為0.3～0.5 mol/L時，石莼多糖的降解率范圍為(44.61±0.17)%～(57.87±0.78)%。故本研究選擇0.3～0.5 mol/L為石莼多糖部分降解的適宜硫酸溶液濃度范圍。

2.2 降解溫度對石莼多糖降解率的影響

溫度的升高加快了反應體系中分子的運動，反應活化能降低，反應更易發生[11]。如圖2所示，在本研究所設的降解溫度范圍內，石莼多糖的降解率隨降解溫度的升高而極顯著(P<0.01)提高。當降解溫度為90～100℃時，石莼多糖的降解率范圍為(45.33±0.30)%～(61.97±0.06)%。故本研究選擇90～100℃為石莼多糖樣品部分降解的適宜降解溫度范圍。

2.3 多糖濃度對石莼多糖降解率的影響

如圖3所示，在本研究的多糖濃度范圍內，石莼多糖降解率隨多糖濃度的增大而呈先上升后下降趨勢。多糖濃度在5 mg/mL范圍內，石莼多糖的降解率隨多糖濃度的增大而極顯著(P<0.01)提高；當多糖濃度為5 mg/mL時，其降解率達到最大值，為(48.02±0.76)%；而多糖濃度超過5 mg/mL后，其降解率顯著(P<0.05)下降。這是因為當酸溶液濃度一定且多糖濃度比較低時，多糖分子不足，其O原子未能與H+充分反應，此時降解率與多糖濃度呈正相關關系；但當多糖濃度超過一定水平后，體系黏度提高、分子流動性下降，反而阻礙多糖分子中O原子與H+反應，故其降解率反而下降。故本研究選擇5 mg/mL為石莼多糖部分降解的適宜溶液多糖濃度。

2.4 降解時間對石莼多糖降解率的影響

如圖4所示，在降解時間2.0 h內，石莼多糖的降解率隨降解時間的延長而極顯著(P<0.01)提高；在超過2.0 h后，其降解率上升趨勢減緩，但仍顯著(P<0.05)提高。這是因為降解反應初期，降解時間的延長使反應充分，多糖降解率也隨之增大，但由于酸溶液會優先降解表面結構上容易水解的糖苷糖，如支鏈糖苷鍵、α-糖苷鍵、呋喃糖的糖苷鍵等[12]，而被包埋在多糖分子內部的糖苷糖[13]不易水解，從而導致在降解一定時間后，多糖的降解率增加幅度變小。降解時間在1.0～1.5 h范圍內，石莼多糖的降解率范圍為(46.85±0.98)%～(56.35±1.20)%，故本研究選擇1.0～1.5 h為石莼多糖部分降解的適宜降解時間。

2.5 石莼多糖部分降解關鍵工藝優化

2.5.1 方程回歸及方差分析

采用Design Expert.v 8.0數據處理系統對表2的數據進行處理分析，分別建立石莼多糖降解率(Y1)與硫酸溶液濃度(X1)、降解溫度(X2)、多糖濃度(X3)的數學回歸方程，刪除方程中P>0.05的不顯著系數項，得到簡化的數學回歸方程式(2)：

式中自變量取各代碼值，因變量取計算值，由回歸方程(2)可分別計算出石莼多糖降解率(Y1)值。表3回歸方程的方差分析數據顯示，方程回歸極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，相關系數R2大于0.990 0，表明回歸方程有意義且擬合度良好。數據還顯示，X1X2(硫酸溶液濃度與降解溫度)、X1X3(硫酸溶液濃度與多糖濃度)、X2X3(降解溫度與多糖濃度)的交互作用均極顯著(P<0.01)影響石莼多糖降解率(Y1)。

表3 方差分析表

注：*、**分別表示在α為0.05、0.01水平顯著。

Notes：*was significant difference，**was extremely significant difference.

2.5.2 因素間的交互效應分析

根據回歸方程(2)，分別得到硫酸溶液濃度(X1)、降解溫度(X2)、多糖濃度(X3)對石莼多糖降解率(Y1)影響的響應面圖和等高線圖，如圖5～7所示。

由圖5可知，當降解液的多糖濃度(X3)固定于0水平(5 mg/mL)時，在本試驗范圍內，X1X2(硫酸溶液濃度與降解溫度)的交互作用與石莼多糖降解率(Y1)呈顯著(P<0.05)正相關關系；當硫酸溶液濃度(X1)與降解溫度(X2)均為1.0水平(0.50 mol/L、100℃)時，石莼多糖降解率(Y1)達到最大值。

由單因素試驗2.1、2.2結果分析可知，硫酸溶液濃度的提高可促進H+與多糖分子上O原子結合，從而促進多糖的降解，與此同時，溫度的升高增大了酸解液體系中的分子動能，H+與多糖分子碰撞機率增大，因此當硫酸溶液濃度與降解溫度均提高時，二者的協同作用使石莼多糖降解率顯著提高。

由圖6可知，當降解溫度(X2)固定于0水平(90℃)時，硫酸溶液濃度(X1)在1.0水平(0.50 mol/L)、多糖濃度(X3)在0水平(5 mg/mL)范圍內，二者的交互作用與石莼多糖粗品的降解率(Y1)呈顯著(P<0.05)正相關關系；當硫酸溶液濃度(X1)在1.0水平(0.50 mol/L)、多糖濃度(X3)在0水平(5 mg/mL)時，石莼多糖粗品降解率(Y1)達到最大值；而當硫酸溶液濃度(X1)大于1.0水平(0.50 mol/L)、多糖濃度(X3)大于0水平(5 mg/mL)后，二者的交互作用與石莼多糖粗品降解率(Y1)呈顯著(P<0.05)負相關關系。

由單因素試驗2.1、2.3結果分析可知，硫酸溶液濃度與多糖濃度的適當提高均可促進H+與多糖分子上O原子結合，從而促進多糖的降解，二者協同作用使石莼多糖粗品降解率顯著提高；而當多糖濃度過高時，酸解液體系黏度增大、分子流動性下降，H+與多糖分子上O原子結合受阻，故二者的交互作用與石莼多糖粗品降解率呈負相關關系。

由圖7可知，當硫酸溶液濃度(X1)固定于0水平(0.40 mol/L)時，降解溫度(X2)在1.0水平(100℃)、多糖濃度(X3)在0水平(5 mg/mL)范圍內，二者的交互作用與石莼多糖粗品的降解率(Y1)呈極顯著(P<0.01)正相關關系；當降解溫度(X2)與多糖濃度(X3)分別為1.0、0水平(100℃、5 mg/mL)時，石莼多糖粗品降解率(Y1)達到最大值；而當降解溫度(X2)大于1.0水平(100℃)、多糖濃度(X3)大于0水平(5 mg/mL)后，X2X3交互作用與石莼多糖粗品降解率(Y1)呈極顯著(P<0.01)負相關關系。

由單因素2.2、2.3的結果分析可知，降解溫度的升高增大了酸解液體系中的分子動能，H+與多糖分子碰撞機率增大，促進降解，與此同時，多糖濃度的適當提高亦可促進H+與多糖分子接觸，因此在一定范圍內，降解溫度與多糖濃度均提高時，二者協同作用使石莼多糖粗品降解率顯著提高；而當多糖濃度過高時，酸解液體系的黏度顯著增大，體系中分子流動性下降，H+與多糖分子結合受阻，該現象產生的結果超過溫度提高導致的分子動能增加，因此當降解溫度與多糖濃度均過高時，二者的交互作用與石莼多糖粗品降解率呈負相關關系。

2.5.3 工藝參數優化及驗證試驗

采用Design Expert.v 8.0軟件求解回歸方程(2)，計算求得石莼多糖降解率(Y1)符合(50±1)%的優化工藝條件組合共42組，表4中分別體現了其部分工藝條件組合及其對應石莼多糖降解率的預測值。綜合考慮透析周期、生產成本、節能與環保問題，并基于實際操作的便利性進行校正，確定石莼多糖部分降解的最優工藝條件組合為硫酸溶液濃度0.30 mol/L、降解溫度95℃、多糖濃度7 mg/mL。為驗證試驗結果的客觀性，根據修正條件進行擴大性驗證試驗，降解時間均為1.0 h，試驗平行重復3次，測得石莼多糖的降解率平均值為50.94%，與其對應理論預測值50.45%無顯著性差異(P>0.05)。

表4 最優工藝條件組合及降解率預測值

3 小結

本研究采用稀硫酸降解法，對石莼多糖進行部分降解，以50%為目標降解率，分別探討了主要工藝因素對石莼多糖降解率的影響，并采用三因素三水平響應分析法對石莼多糖部分降解關鍵工藝參數進行優化。試驗結果表明：校正后，石莼多糖部分降解的最優工藝條件組合為硫酸溶液濃度0.30 mol/L、降解溫度95℃、多糖濃度7 mg/mL，在結合降解時間1.0 h的條件下，石莼多糖的平均降解率為50.94%。

綜上所述，采用稀硫酸溶液對石莼多糖進行部分降解，結果穩定、周期短、工藝簡單、易實現工業化，具有可行性。