高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳粉中低聚半乳糖

甄振鵬，高裕鋒*，黃敏興，龐揚(yáng)海，王小鵬，李碩聰，余構(gòu)彬

（1廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所） 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣東廣州510316）

0 引言

棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖是 α-1,6-糖苷鍵連接的低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）[1]。棉籽糖的分子結(jié)構(gòu)是蔗糖靠近葡萄糖一側(cè)以 α-1,6-糖苷鍵連接一個半乳糖，屬于三糖。水蘇糖是棉籽糖靠近半乳糖一側(cè)以α-1,6-糖苷鍵連接一個半乳糖，屬于四糖。而毛蕊花糖則是在水蘇糖末端半乳糖再以α-1,6-糖苷鍵連接一個半乳糖，屬于五糖[2]。

棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖具有促進(jìn)腸道有益菌生長，促進(jìn)消化吸收，改善脂質(zhì)代謝，降低血脂和膽固醇，促進(jìn)鈣和鎂等礦物元素的吸收，提高免疫力等生理功能，因此常被添加到各類功能性食品中[3]。尤其是在嬰幼兒乳粉中，往往人為添加低聚半乳糖，以模擬人乳中含有低聚半乳糖的狀態(tài)，起到促進(jìn)嬰幼兒的消化吸收作用。棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖是低聚半乳糖的重要組成品種。

目前，國內(nèi)并沒有完善成熟的檢測乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的標(biāo)準(zhǔn)，這使得相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)管缺失，不利于保障乳制品的質(zhì)量安全。因此，開發(fā)乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的檢測方法，具有重要的意義。

利用高效液相色譜配示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器以及離子色譜檢測棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖已有一些文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]。如目前國內(nèi)已發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22491-2008《大豆低聚糖》涉及了棉籽糖和水蘇糖的檢測方法[8]。利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法開發(fā)牛奶中低聚半乳糖及其他低聚糖是近年來研究的熱點(diǎn)[9-11]，它可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性和定量的目的。本文擬利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合前處理方法的研究，開發(fā)一種乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的測定方法，并將其用于實(shí)際樣品檢測中。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（液相：日本島津公司LC-20AD；質(zhì)譜：美國 ABI公司，4000Q trap）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；Vortex-Genie 2渦旋混勻器（奧然科技有限公司）；電子天平（0.1 mg，日本AND公司）。

棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖標(biāo)準(zhǔn)品購自于日本W(wǎng)ako公司；甲醇（色譜純，美國默克公司）；乙腈（色譜純，美國默克公司）；有機(jī)相濾膜購于天津博納艾杰爾科技公司。

實(shí)驗(yàn)所用的 33種乳粉樣品為市場中隨機(jī)購買的產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精確稱取棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖各10 mg置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水超聲溶解定容至刻度，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。將此混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，分別配成低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 1500、1000、500、200、100和50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 提取和凈化

稱取乳粉樣品1 g（精確至0.01 g）于50 mL比色管中，加入30 mL蒸餾水溶解（充分振蕩），再用20 mL無水乙醇定容至50 mL，渦旋振蕩，超聲20 min，移取約25 mL溶液于50 mL離心管中，以8000 r/min離心5～10 min，離心機(jī)溫度10℃，精密移取上清液過0.22 μm水相濾膜至進(jìn)樣瓶中，取濾液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.4 HPLC-MS/MS分析

1.4.1 HPLC條件

色譜柱：XBridgeTMAmide （150 mm×4.6 mm×3.5 μm）；流動相 A：40/60的乙腈/水溶液含 0.10%氨水溶液，流動相B：70/30的乙腈/水溶液含0.10%氨水溶液；梯度洗脫：0～30 min 0%～40% A；30～33 min 40%～60% A；33～35 min 60% A；35～37min 60%～0% A；37～38min 0% A。

流速：0.4 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI-；儀器參數(shù)：氣簾氣壓力344.5 kPa，碰撞氣壓力中檔，離子噴霧電壓 4500 V，離子源溫度550℃，霧化氣壓力344.5 kPa，輔助加熱氣壓力344.5 kPa，接口加熱器為開；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM，具體參數(shù)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的選擇

由于低聚半乳糖水解電離都能產(chǎn)生各種單糖雙糖離子，質(zhì)譜無法分離，因此對于色譜分離要求高，才不造成相互影響（見圖1）。采用檢測糖類專用的氨基柱，單純使用乙腈水流動相無法將各種低聚半乳糖有效分離。通過考察不同流動相比例對檢測分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)以 40/60的乙腈/水溶液（水中含0.10%氨水）作為A相，以70/30的乙腈/水溶液（水中含0.10%氨水）作為B相，按照1.4.1的洗脫方式，可以實(shí)現(xiàn)有效的分離，并且提高負(fù)離子模式下的靈敏度。

質(zhì)譜條件優(yōu)化方法是：在注射泵直接進(jìn)樣的條件下，在負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定低聚半乳糖的分子離子峰，然后以該分子離子峰為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，獲得二級質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)的子離子，最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行采集，并獲得去簇電壓和碰撞能量等相關(guān)參數(shù)，具體參數(shù)如表1所示，使所測的質(zhì)譜峰強(qiáng)度最優(yōu)。

2.2 沉淀溶劑的選擇與優(yōu)化

表1 3種低聚半乳糖保留時間與多反應(yīng)監(jiān)測條件

圖1 3種低聚半乳糖（1000 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖

由于低聚半乳糖屬于水溶性多糖，因此采用超純水進(jìn)行提取，但乳粉中易溶于水的物質(zhì)多，尤其是蛋白質(zhì)含量高，對檢測造成很大的干擾，因此需要進(jìn)行一些預(yù)處理，降低干擾。本文分別使用無水乙醇、三氯乙酸∶乙酸鉛、乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑，比較其沉淀效果。結(jié)果表明，用無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于用三氯乙酸∶乙酸鉛、乙腈沉淀蛋白質(zhì)的效果。通過比較6∶4、5∶5、4∶6的無水乙醇∶水溶液的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4∶6的無水乙醇∶水溶液的提取效果明顯優(yōu)于其他2種，因此采用此溶劑作為提取溶劑。

2.3 方法線性范圍和檢出限

用50～1500 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度（x）和峰面積（y）計(jì)算的線性方程見表2。結(jié)果表明，3種低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9986～0.9997，線性良好。方法檢出限（LOD）以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比 S/N=3計(jì)算得出。定量限（LOQ）以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N=10計(jì)算得出。結(jié)果如表2所示，可以滿足3種低聚半乳糖痕量分析的需要。

2.4 回收率和精密度

表2 3種低聚半乳糖的方法檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

分別準(zhǔn)確添加3種低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白乳粉樣品中，設(shè) 3個添加濃度，每個濃度分別做 6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，按上述方法測定，以得到的平均回收率評價(jià)分析方法的準(zhǔn)確度，以6次測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價(jià)方法的精密度。添加水平為100、500、1000 μg/kg，平均添加回收率在80.8%～86.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 8%（見表 3），均在允許范圍內(nèi)，符合殘留分析的要求。

表3 乳粉中3種低聚半乳糖平均回收率和精密度數(shù)據(jù)表（n=6）

2.5 實(shí)際樣品測試

為了驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用，本文檢測了市面上33種不同乳粉的低聚半乳糖含量，結(jié)果如表4所示。實(shí)際樣品檢測結(jié)果表明，毛蕊花糖的添加量是最少的，大多低于10 mg/kg，但都會存在于各大品牌的乳粉中，棉籽糖和水蘇糖添加量相對較多，但是基本情況是棉籽糖添加量多，則水蘇糖就添加少量或者不添加。

3 結(jié)論

通過對前處理方法和色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了乳粉中低聚半乳糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法簡單、快速、準(zhǔn)確，可實(shí)際應(yīng)用于乳粉中低聚半乳糖的批量檢測，能有效提高工作效率、降低分析成本。實(shí)際樣品檢測結(jié)果表明，毛蕊花糖的添加量是最少的，但都會存在于各大品牌的乳粉中，棉籽糖和水蘇糖添加量相對較多，但是基本情況是棉籽糖添加量多，則水蘇糖就添加少量或者不添加。