缺血再灌注損傷大鼠學習記憶能力損傷及其與海馬突觸素表達水平的相關性研究

李建鴻，黃佳，宋長明，楊敏光，金婷婷，柳維林，陶靜，陳立典

認知功能障礙是腦卒中后常見的功能障礙之一，大約2/3的腦卒中患者遺留有認知功能障礙問題[1-2]。腦卒中是特定腦區供血障礙的急性神經系統疾病，腦卒中發生后在缺血腦區不同類型神經元均會出現損傷及死亡，但是研究發現海馬CA1區的錐狀神經元對缺血缺氧尤為敏感[3-4]。而海馬在記憶的形成、組織和提取過程中發揮重要作用，海馬結構和功能的完整性是正常學習記憶所必須的，因此海馬神經元損傷與腦卒中后學習記憶能力下降密切相關[5-6]。因此本課題選取海馬作為學習記憶能力障礙的相關研究腦區。突觸可塑性是學習記憶的基礎，而突觸是突觸可塑性的關鍵部位[7]，突觸前膜、突觸后膜分布著許多信號分子，海馬突觸素(synaptophysin，SYN)是其家族重要成員之一，其參與突觸傳遞效能的調控，被認為是突觸密度與分布的一個重要表現，在突觸可塑性中發揮重要作用，與突觸重塑和認知過程密切相關[8]。有研究表明大鼠腦梗死后的神經功能缺損癥狀會伴隨突觸素表達量明顯下降以及神經可塑性破壞[9-10]。故本課題通過觀察大鼠缺血再灌注損傷后學習記憶能力的損傷，檢測海馬突觸素SYN的表達水平，并將二者做相關性分析，探討缺血再灌注損傷大鼠學習記憶能力損傷的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：將從上海斯萊克實驗動物責任有限公司[許可證號：SCXK(滬)2012-003]購買的體質量(250.0±30.0)g的16只SPF級雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠于福建中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(閩)2013-005]分籠、適應性喂養1周，并對大鼠進行編號、稱重進行后續實驗。實驗過程均嚴格按照國際動物保護和使用指南的規定操作。②主要試劑和儀器：小鼠來源Anti-Synaptophysin抗體(Abcam，ab8049)、Goat anti-mouse IgG二抗(Proteintech，SA00001-1)、線栓(3600AAA，廣州佳靈生物技術有限公司)、7.0 T小動物核磁共振儀(Pharmascan; microMRI, Bruker, Germany)、Barnes迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)、Bio-Image 分析系統(Bio-Rad Laboratories, Hercu-les, CA, USA)。

1.2 方法 造模與分組：采用隨機數字表法將SD大鼠分為模型組(n=10)和對照組(n=6)，參考改良Longa線栓阻塞法[11]，對模型組大鼠行左側大腦中動脈栓塞法(Middle Celebral Occlusion，MCAO)造模。造模前12h對大鼠禁食并稱重，造模前首先用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)，待大鼠進入麻醉狀態后沿頸正中切口切開皮膚，暴露出左側頸總、頸外和頸內動脈并使之分離，隨后結扎頸總、頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內動脈。在左側頸總動脈的結扎處上方用眼科剪剪一“V”型小口，將線栓沿著頸總動脈向頸內動脈方向輕緩推入，推至頸內動脈夾夾閉處時松開動脈夾，繼續將線栓推到顱內，感到有輕微阻力便停止推入，造成局灶性腦缺血并開始計時，縫合皮膚，清潔創口，待90min后抽出線栓。對照組大鼠僅對其左側頸總、頸內、頸外動脈進行分離，但是不插線栓。待大鼠蘇醒、恢復活動后，通過Zea-Longa 5分法記錄大鼠得分情況并以此檢測大鼠神經功能損傷情況判斷造模是否成功(Zea-Longa評分在1～3分視為造模成功)。造模結束后，模型組有3只大鼠出現死亡，1只大鼠造模不成功(Zea-Longa評分為0分)，最后模型組造模成功6只全部納入實驗，對照組大鼠6只全部存活納入實驗。

1.3 觀察指標 ①Zea-longa神經行為學評分：造模后2h，大鼠完全清醒恢復活動，對其行Zea-Longa神經功能缺損評分，根據 Zea-Longa 5分制評分標準，評分在1～3分之間的大鼠被認為造模成功。具體評分分級如下：0分，無神經缺損癥狀；1分，右前肢內收，懸尾測試后不自覺向右側旋轉；2分，放在地面后會不自覺的向右側轉圈；3分，無法走直線，肢體向右側傾斜；4分，完全無意識，無法行動。② T2W1觀察腦梗死體積：在造模24h后分別對2組大鼠行核磁共振掃描。用5%異氟烷誘導麻醉5min后，2%的異氟烷維持麻醉對3組大鼠進行T2WI掃描，用動物生理檢測儀密切觀察掃描大鼠的呼吸、心率。觀察大鼠左側大腦梗死體積。T2WI掃描參數：TR 2738 ms，TE 33 ms，TR/TE=4111.669/55ms，FOV=32×32mm，Averages=2，Matrix=256×256，Slices=21，Slice Thickness=0.8mm， Time=5min50s。掃描完成后采用Image J軟件計算腦梗死體積。③Barnes迷宮檢測學習記憶能力：Barnes迷宮的主體是一個黑色圓形平臺，該平臺直徑為122cm，在平臺周圍分布有20個等距、等大的圓形鏤空小洞，每個鏤空小洞的洞口直徑都是10cm，其中一個洞口下方放置一個黑色不透光的盒子(目標盒)作為大鼠的安全躲避場所；而其它洞的底部不放置盒子。每次檢測前先將大鼠于目標盒內放置30s，檢測過程中采用噪聲或風吹等干擾刺激促使大鼠進入目標盒、安全躲避。造模后第3天開始迷宮測試，首先把大鼠放置在圓形平臺中央的起始盒內，拿走起始盒后開始300s倒計時，在這個過程中記錄其進入目標盒所用的時間(逃避潛伏期)和探索錯誤洞口的次數(口、鼻、四肢對洞口的觸碰均記為探索)，連續5d。若大鼠在300s內未找到目標洞口進入目標盒，記逃避潛伏期為300s。每次測試結束后都旋轉上層圓形平臺并用70%的酒精紗布進行擦拭清洗平臺、目標盒以防止大鼠憑借氣味尋找到目標盒，但要保持目標盒的相對空間位置不變。各組進入錯誤洞口次數、逃避潛伏期的計算方式皆取5d的平均值。④免疫印跡蛋白檢測SYN表達水平：Barnes迷宮測試結束后將大鼠麻醉、斷頸后快速分離左側大腦海馬置于-80℃冰箱保存。每100mg腦組織加1ml細胞裂解液和10ul 的PMSF儲存液，充分研磨后離心，取上清液，用BAC法測定蛋白濃度。待樣品蛋白變性后，取50ug樣品蛋白，經10%SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜上。在室溫條件下封閉2h，用SYN(1：1000)和β-action(1:8000)一抗孵育，于4℃冰箱過夜，第2天加入相應的二抗(1:2000)于室溫下放置1h。最后將PVDF膜放置在圖像掃描儀上，避光配置顯色液并將其覆蓋于PVDF膜上，反應1min，用Image-lab圖像分析系統分析處理。用目標條帶灰度值占β-action條帶灰度值的百分比來反應目標蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 Zea-longa神經行為學評分 造模2h后，對符合模型組納入標準的6只大鼠重新編號，其Zea-longa神經行為學評分分別為2、2、3、2、1及3分。對照組大鼠6只Zea-longa評分結果均為0分。

2.2 腦梗死體積 T2W1掃描結果顯示：造模24h后，模型組大鼠6只出現腦梗死，箭頭所示，對照組大鼠6只無腦梗死。見圖1。

圖1 2組大鼠造模后24h的T2加權成像

2.3 Barnes迷宮測試結果 Barnes結果顯示：對照組尋找目標盒路徑清晰直接；模型組路徑雜亂無章、毫無目標性，見圖2。與對照組相比，模型組大鼠尋找到目標盒的平均潛伏期顯著延長(P<0.01)；模型組進入錯誤洞口的平均次數顯著增加(P<0.01)，見表1。

對照組 模型組

組別n潛伏期(s)進入錯誤洞口次數(次)對照組699.38±11.668.59±1.38模型組6212.43±20.08a23.44±1.25a

與對照組比較，aP<0.01

2.4 SYN表達水平 免疫印跡蛋白結果顯示：與對照組相比，模型組大鼠SYN表達水平顯著下降(0.56±0.23、1.27±0.33，P<0.01)。

2.5 SYN表達水平與大鼠學習記憶能力相關性 SYN表達水平與大鼠逃避潛伏期顯著負相關(r=-0.916，P<0.05)，見圖3；SYN表達水平與大鼠進入錯誤洞口次數顯著負相關(r=-0.87，P<0.05)，見圖4。

圖3 SYN表達量與大鼠逃避潛伏期相關性

圖4 SYN表達水平與進入錯誤洞口次數相關性

3 討論

海馬在學習記憶等認知功能過程中起關鍵性作用[12]，一項關于雙側海馬損傷的人類行為研究顯示海馬損傷與空間記憶缺陷有關，表現為生活中不能進行正確的空間導航而迷路[13]。有關海馬損傷在嚙齒類動物中的研究更為廣泛，包括空間工作記憶損傷[14]，對于相似環境的辨別能力障礙等[15]。本課題通過Zea-longa神經行為學評分及核磁共振成像掃描，證明了缺血再灌注模型制備成功，并且模型組大鼠出現不同程度的海馬損傷。隨后本課題通過Barnes迷宮對大鼠學習記憶能力進行檢測，實驗結果表明模型組大鼠學習記憶能力下降明顯，表現為在迷宮測試過程中逃避潛伏期延長以及進入錯誤洞口次數的增多。

學習記憶能力下降會伴隨海馬活動紊亂其很可能與神經遞質釋放、神經調節受損密切相關[16-17]。而突觸小泡介導的遞質釋放是神經元信息傳遞的主要機制，在神經傳遞的過程中突觸素被認為可以調節突觸小泡的循環效率，被認為與突觸可塑性密切相關。Schmitt等[8]對突觸素基因敲除的小鼠進行試驗，結果發現與野生組小鼠相比，突觸素基因敲除的小鼠出現明顯的學習記憶能力下降，在加強曠場實驗中表現為對新穎物體的辨識度下降，在水迷宮訓練的空間探索實驗過程中逃避潛伏期明顯延長，在定位航行過程中進入目標象限時間明顯減少，而視網膜電圖參數顯示基因敲除小鼠與野生鼠無差異，表明學習記憶能力下降并非是由于視力損傷導致的。海馬接受從內嗅皮層而來的神經投射，該環路與學習記憶能力相關，Smith等[18]發現老年大鼠海馬突觸素表達減少，這可能是老年大鼠學習記憶能力下降的重要原因之一。同樣的，有研究分別對3月齡、12月齡和26月齡大鼠海馬突觸素蛋白進行檢測，結果發現隨著月齡增加，大鼠海馬區突觸素表達顯著下降[19]。在人類研究水平上突觸素也被證明與認知功能密切相關，Li等[20]的研究表明了在圍生期及嬰幼兒期鉛暴露過多導致的認知功能障礙很可能是由海馬突觸素表達水平下降引起的。不僅如此，腦組織突觸素蛋白表達量下降已見于多種神經系統退行性疾病，臨床尸檢已證實阿爾茨海默病患者前額葉和海馬等腦區突觸素表達下降，并且其表達水平與臨床癥狀呈負相關[21]。突觸素蛋白在腦缺血再灌注損傷大鼠模型已有相關研究，Hou等[22]的研究顯示腦缺血再灌注損傷后的神經缺損與突觸素蛋白減少有關。早期研究表明電針、藥物等治療方法均可通過提升大腦突觸素表達水平改善缺血再灌注大鼠學習記憶能力、促進運動功能的恢復[23-24]。但是未有研究對缺血再灌注損傷后學習記憶能力損傷與突觸素蛋白之間相關性進行研究。

本課題通過蛋白免疫印跡技術檢測大鼠海馬突觸素表達水平，結果發現與對照組相比，模型組大鼠海馬突觸素表達量顯著下降。并且相關性分析表明模型組大鼠海馬突觸素表達水平與大鼠逃避潛伏期、進入錯誤洞口次數呈顯著負相關。這些研究結果揭示了：缺血再灌注損傷導致的學習記憶能力下降可能與海馬突觸素SYN表達水平下降，導致突觸可塑性受損有關，并且隨著SYN表達的下降，大鼠學習記憶能力受損越嚴重。這一結果可為后續研究奠定理論基礎。