一株罕見Ihumii放線菌的分離和鑒定

張維清，林宇嵐，甘龍杰，陳守濤，張文明，楊 濱△

(福建醫科大學附屬第一醫院：1.檢驗科；2.骨科，福建福州 350005)

放線菌大多存在于健康人口腔、上呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等與外界相通的腔道，是寄居人體的一種正常菌群[1-2]。當機體免疫力減弱、口腔衛生不良、拔牙或外傷時，可侵入組織導致皮膚、皮下組織，肌肉，骨骼及中樞神經系統化膿性感染[3]。根據感染的途徑和涉及的器官不同，臨床上分為面頸部、胸部、腹部和中樞神經系統感染。其主要特征為慢性化膿性肉芽腫病變，以向周圍組織擴展形成瘺管并排出帶有硫磺樣顆粒的膿液為特征。絕大多數放線菌易引起內源性感染，大量應用免疫抑制劑是一個重要的誘發因素。2015年，法國科學家從一個50歲的HIV感染者糞便中首次分離出一株新的放線菌，并命名為Ihumii放線菌[4]。福建醫科大學附屬第一醫院于2016年收治一例由Ihumii放線菌引起的膝關節化膿性感染，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男，72歲，既往患有高血壓和甲狀腺功能亢進。就診本院前2月因外傷致“左膝髕骨粉碎性骨折”，于院外行“左髕骨骨折切口復位內固定術”，術后切口愈合不良。術后1個月，因“左膝切口裂開”再次求診，該院行“左膝部二期清創術”，術后10 d切口流出黃膿液、發惡臭、伴發熱。遂于當地醫院多次行清創術，治療上予抗感染、補液及對癥治療(具體不詳)，今為求進一步診治，患者就診福建醫科大學附屬第一醫院骨科，門診擬“左膝關節感染”收入住院(圖1A)。實驗室檢查,白細胞計數(WBC):17.9×109/L,血紅蛋白(Hb):112 g/L,血小板計數(PLT):230×109/L,C反應蛋白(CRP):59.5 mg/L,PCT:0.38 ng/mL。

1.2儀器與試劑 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)、甲酸、α-氰基-4-羥基苯丙酸(HCCA)均由德國Bruker公司及Sigma公司提供；ABI 2700普通PCR儀(美國應用生物系統)；快速革蘭染色液(Baso)；細菌16S rRNA 基因擴增通用引物：27f:AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 和1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT由上海生工合成，PCR反應體系采用美國Promega公司產品。

1.3細菌培養及形態觀察 膿液分泌物標本分區劃線接種于2塊哥倫比亞血平板、一塊沙保羅葡萄糖瓊脂培養基、一塊選擇巧克力平板。一塊血平板與選擇巧克力平板置于5%二氧化碳培養箱中，35 ℃恒溫孵育，每天觀察血平板的生長情況；另一塊血平板行厭氧培養，35 ℃恒溫孵育，每天觀察平板的生長情況。沙保羅葡萄糖瓊脂培養置于25 ℃恒溫孵育，亦每天觀察其生長狀況。術后壞死組織經研磨后，亦行上述同條件培養。根據第四版《全國臨床檢驗操作規程》，陽性培養進行革蘭染色，油鏡觀察菌體形態。

1.4細菌MALDI-TOF-MS鑒定 用牙簽挑取單個待檢菌落，均勻涂抹于加樣金屬靶板小圈內，同時在另一小圈內亦均勻涂抹ATCC25922大腸埃希菌質控菌株，待樣本室溫干燥后，加入1 uL的甲酸(70%)，室溫干燥后，加入1 μL的HCCA，待室溫干燥后上機檢測。

1.516S rRNA基因擴增及系統發育樹的構建 采用煮沸法提取細菌的基因組核酸。細菌16S rRNA的PCR擴增條件參考文獻[5]。擴增產物經電泳，確認存在目的條帶，產物送上海生工測序。測序的序列用Vector NTI 8.0軟件包中的Contig Express組件拼接。獲得的16S rRNA序列在GeneBank中進行Blast同源性比對初步確定其分類位置。用Bioedit(vision3.3)合并樣本序列(序列名2016R)和參考序列為一個隊列，用MEGA5.1軟件以Kimura雙參數方法構建16S rRNA系統進化樹。

2 結 果

2.1病原菌培養結果 膿液和術后壞死組織經分離培養后，均得到一株革蘭陽性短桿菌。其生長速度較緩慢，初次培養48 h后可形成直徑大約1～2 mm、灰白色、圓形、光滑、突起、邊緣整齊、無β溶血性菌落(見圖1B)，與文獻報道的一致[4]。在沙保羅葡萄糖瓊脂培養基和選擇巧克力平板均不能生長。

注：A為患者入院時左膝關節創傷伴化膿性感染；B為5%CO2培養箱35 ℃培養48 h后血平板菌落形態

2.2細菌MALDI-TOF-MS鑒定結果 目標菌通過MALDI-TOF-MS檢測及BioType軟件分析，獲得的目標菌肽指紋圖譜如圖2示。鑒定結果報告顯示為瑞丁放線菌，但可信度為1.902。根據MALDI-TOF-MS報告對結果的解讀[6]，當可信度值為1.700～1.999時，可鑒定放線菌屬，不能確定為放線菌某種，需進一步鑒定。

圖2 Ihumii放線菌MALDI-TOF-MS鑒定結果圖

圖3 2016R放線菌部分16S rRNA基因與Ihumii放線菌及其他放線菌系統進化樹

2.316S rRNA基因序列鑒定及進化樹分析 擴增得到16S rRNA基因的反向序列，大小約870 bp，正向多次測序均失敗，存在較多雜峰、背景信號干擾，所以未納入本次分析中。反向的一半16S rRNA序列經編輯，提交NCBI的Blast顯示，其與Ihumii放線菌(核酸登錄號為LN866997和NR144728.2)相似率為100%。為了能夠更直觀反映該菌來源，本課題組利用MEGA5.1軟件Neighbor-joining tree法，構建16S rRNA進化樹。如圖3所示，可以明顯看出，本次發現的2016R放線菌株與2株2015年由法國科學家發現的Ihumii放線菌明顯在一簇上，Bootstrap值為72%。而且，他們共同與其他參考放線菌成一簇，Bootstrap值為99%。

3 討 論

放線菌病是一種少見的因感染放線菌所致的慢性感染性疾病，人獸共患，可產生局部化膿或肉芽腫性疾病，以多發膿腫和竇道瘺管為特征。根據現有的文獻報道，放線菌病存在明顯的區域和性別差異，農村明顯高于城市，男性多于女性，城市發病率僅為農村的1/10，男女比例約為3∶1[7]。目前放線菌屬內有47個種，由于其生在緩慢、培養條件苛刻，在行常規細菌培養時，容易被遺漏[8]。同時，又由于國內對放線菌感染臨床特點、診斷、鑒別診斷等研究仍較少，而且，該菌屬所致疾病常呈隱匿性，缺乏較為典型的臨床表現，容易造成臨床醫生的診斷與治療困難，產生誤診或漏診。MALDI-TOF-MS是最近發展起來的一種可以快速鑒定細菌的新技術，依據不同菌種形成特異性的質譜指紋圖譜對細菌進行鑒定，該技術可以快速、準確鑒定臨床常見菌[9]，但對少見、罕見菌鑒定時，由于其菌譜庫中種類數量有限，其在鑒定方面仍存在著缺陷[6]。據LYNCH等[10]報道，MALDI-TOF-MS在鑒定放線菌方面，僅41%的放線菌能準確鑒定到種，9%鑒定到屬，存在50%無法準確鑒定。本文開始采用MALDI-TOF-MS進行鑒定，并以鑒定為瑞丁放線菌種，但鑒定值為1.902，所以可以確定2016R為放線菌屬某種，但無法確定其準確種。

利用16S rRNA序列同源性分析對細菌進行分類鑒定的技術已經比較成熟。隨著GeneBank數據庫的不斷完善，應用該技術可以對病原菌進行快速、準確簡便的分類鑒定。目前，應用16S rRNA鑒定細菌菌屬時，當目標菌與GeneBank中比對序列相似度大于99%，可以鑒定為種；相似度為97%～99%，鑒定為屬；相似度低于97%，無法鑒定，可能為某種新的細菌[11]。因此，本研究又采用16S rRNA測序技術對菌株進一步復核鑒定，最終與Ihumii放線菌相似度為100%；同時如圖3所示，2016R菌株與Ihumii放線菌成一簇，由此可以鑒定本研究新發現的菌株為Ihumii放線菌。本研究相對不足之處是未得到16S rRNA約1 500 bp長度的序列，盡管如此，但根據以往的文獻報道，序列在300～900 bp之間就可以適用于多數廣譜PCR的診斷[12]。所以本研究中870 bp長度的序列在通過GeneBank中比對和進化樹分析后是可以確定該菌就是Ihumii放線菌的。

對于膝關節創傷放線菌感染，由于病例較少，目前尚無統一的治療方案。根據相關文獻報道[13]，目前多首選β-內酰胺類抗菌藥物進行治療，在臨床治療過程中也根據藥敏結果使用一種或多種抗菌藥物聯合治療，療程約為6到12個月，早期診斷及有效抗菌藥治療的治愈率可達90%[14]。但也有專家指出，在治療中應按照患者具體病情情況、感染部位的不同，選擇手術或非手術治療[15]。本病例中患者創傷明顯、組織壞死、膿液外流，通過手術，不但可以清除壞死組織加速傷口愈合，而且能夠獲取深部膿液、壞死病灶等送微生物室培養和病理檢查。該患者最終經過清創、皮瓣移植、抗菌藥物應用，3個月及半年后回訪復查，患者得以痊愈。

放線菌病在目前的臨床病例中并不常見，其診斷除了需要影像學、病理學分析外，更重要的是臨床醫生能否正確采集膿液、組織標本，及時送檢，為微生物實驗室提供合格標本。臨床微生物工作者也需要加強對放線菌病的認識，有條件是實驗室可適當開展更可靠的現代診斷方法，如基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜、分子生物學分類方法，以便能快速診斷放線菌病并指導臨床醫生合理用藥。同時，本病例提示，在處理感染性疾病時，除了常見細菌、真菌、病毒感染外，要警惕少見菌、罕見菌的感染，以免誤診耽誤治療，危及患者生命安全。