長鏈非編碼RNA -AFAP1-AS1在神經膠質瘤中表達水平及影響預后的相關因素研究

于慶偉，秦彥昌，張百平，羅國強

空軍軍醫大學第二附屬醫院神經外科(西安710038 )

膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤，其中70%屬于高病理分級，患者術后復發率和病死率均很高[1]。盡管科研工作者一直致力于探索更有效的治療方法，但由于腫瘤細胞的多樣性和高侵襲力以及膠質瘤患者的異質性，膠質瘤目前仍然是人類最致命的癌癥之一，膠質母細胞瘤患者中位生存期甚至只有12月[2-3]。影響膠質瘤患者的預后因素包括：卡氏行為狀態評分 (KPS) 、組織學分級以及術后復發[4-5]。但目前已有研究表明，單獨的標準可能不足以估計患者預后，因此需要探索一種生物標志物和治療靶點，可進行早期診斷并且可以更準確的預測預后[4-5]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)被廣泛定義為長度大于200個核苷酸并且缺乏開放閱讀框架的RNA分子[9-10]。目前，它已被發現涉及大腦的進化、發展和一些疾病過程，并可用作治療和診斷的新的生物標志物和靶點[11]。之前有研究表明，通過篩選轉錄表達譜發現lncRNAs在膠質瘤組織的表達可發生顯著改變[12]。此外, lncRNAs與膠質瘤的發展和調節細胞生長和轉移的進展有關，表明lncRNAs在膠質瘤發生發展中起重要作用。例如研究者證實，過表達的DANCR可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進膠質瘤的惡性進展[13]。還有實驗顯示lncRNA-ZEB1-AS1的下調可以抑制膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[14]。肌動蛋白絲相關蛋白1反義RNA1(AFAP1-AS1), 位于人的 4 號染色體肌動蛋白絲相關蛋白1(AFAP1)基因反義鏈上，是一個長度約6810 bp的一種長鏈非編碼RNA，已經有相關研究顯示AFAP1-AS1 的表達水平與消化系統腫瘤(胃癌、膽囊癌、食管癌、結直腸癌等)的發生發展和轉移以及患者臨床參數和預后都密切相關[15-18]。然而目前我們對lncRNA AFAP1-AS1在膠質瘤中的作用以及對患者預后的影響所知甚少。為了確定lncRNA AFAP1-AS1表達在膠質瘤中的臨床意義, 我們分析了AFAP1-AS1表達與臨床病理特征的關系, 包括與患者的生存率的關系。我們發現腫瘤組織中AFAP1-AS1表達水平高于正常腦組織。此外, lncRNA AFAP1-AS1的表達與膠質瘤患者的惡性狀況和不良預后都密切相關。

對象與方法

1 研究對象 回顧性統計空軍軍醫大學唐都醫院神經外科2008年1月到2013年1月共70例腦膠質瘤手術切除術患者的臨床資料。選擇標準：①患者沒有其他腫瘤病史；②具備完整的臨床數據，包括：年齡、性別、平均腫瘤直徑、腫瘤數量、病理分級、KPS評分、術后復發情況；③正常腦組織樣本從同期入院進行顱腦內減壓術治療的患者中獲得；④患者術前均未進行放、化療治療或其他抗癌治療；⑤所有入選患者均簽署知情同意書，自愿參與本研究；⑥獲得本院倫理委員會批準。對參與的患者進行5年的隨訪, 隨訪方式為門診復診或進行電話隨訪，統計患者從最初的手術到死亡的日期計算了整體存活率，隨訪截止時間2018年1月。其中因意外事故或因與膠質瘤無關的情況而死亡的患者被排除。

2 研究方法 組織在切除后立即凍結, 儲存在液氮中。采用Trizol 法 (Invitrogen, CA, USA)提取組織標本中的總RNA，然后用紫外分光光度計測定組織標本在波長為260 nm以及280 nm 處的吸光度比值OD 260/280，計算RNA濃度并評估純度，RNA樣品OD值在1.9～2.0范圍內為合格。取 1 μl上述組織總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明將 RNA 逆轉錄為cDNA,反應參數：37 ℃ 反應 15 min (反轉錄)，85 ℃ 反應 5 s。然后應用 RT-PCR法分別檢測神經膠質瘤組織和正常腦組織標本中AFAP1-AS1的表達水平，內參基因設置為GAPDH。引物及探針序列如下：AFAP1-AS1上游引物正向: 5’-AGCCTTGGTGAGCAATAGGT-3’, 下游引物反向: 5’-GGTATGAAGGGTGTGGGTGA-3’, GAPDH上游引物正向: 5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’,下游引物反向: 5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。然后采用2-ΔΔCt法對測得的數據進行相對定量分析，計算AFAP1-AS1在膠質瘤組織和正常腦組織的不同表達水平，所有實驗均重復3次以上。

結果

1 神經膠質瘤組織中AFAP1-AS1表達水平 為了確定AFAP1-AS1在膠質瘤中的作用，我們應用RT-PCR檢測其在組織中的表達情況(圖1)。結果顯示，與相鄰腦正常組織相比, 膠質瘤組織表現出較高的表達水平[膠質瘤組織(2.881±0.273)、正常腦組織(1.000±0.313)，P=0.0007]。同時通過數據對比，AFAP1-AS1的表達水平隨著膠質瘤惡性程度的增高而增高[WHO I～II級(2.250±0.288)、WHO III～IV級(3.512±0.294)，P=0.012]，說明AFAP1-AS1的表達水平與膠質瘤的惡性程度呈正相關。

圖1 LncRNA-AFAP1-AS1在腦組織和腫瘤組織中的表達水平

2 AFAP1-AS1表達與膠質瘤臨床病理指標的相關性 見表1。基于所有膠質瘤的中位表達水平，我們將膠質瘤組織標本分為低表達組(n=38)和高表達組(n=32)。結果顯示：神經膠質瘤組織中高表達水平的AFAP1-AS1與高病理分級(P=0.029)、低KPS 評分(P=0.015)以及患者術后復發(P=0.021)有密切關系，而與患者的年齡(P=0.729)、性別(P=0.762)以及腫瘤大小(P=0.934)等均無關。

表1 LncRNA-AFAP1-AS1表達水平與膠質瘤患

3 AFAP1-AS1的表達水平與膠質瘤患者不良預后的關系 為了探討AFAP1-AS1表達水平在膠質瘤患者中的預后價值, 利用 Kaplan-Meier分析并進行Log-rank試驗, 分析AFAP1-AS1表達水平與患者生存率的關系(圖2)。在70例膠質瘤患者中, 我們發現AFAP1-AS1表達與膠質瘤患者整體生存率成反比。換言之, AFAP1-AS1表達下降的患者總存活率優于AFAP1-AS1表達上升的患者。此外, 我們還發現, AFAP1-AS1的過度表達在膠質瘤患者中表現出明顯不良的預后情況, 無論其等級、腫瘤大小和腫瘤位置如何。進一步研究AFAP1-AS1的表達是否是影響膠質瘤患者預后的獨立因素，以及探索其他可能影響神經膠質瘤患者臨床預后的因素。我們將各患者臨床病理指標與生存率進行了單因素和多因素COX比例風險回歸分析。分析結果顯示：高表達水平的AFAP1-AS1、高組織學分級、KPS評分<80分以及術后復發均為造成膠質瘤患者不良臨床預后的獨立危險因素，見表2。

圖2 LncRNA-AFAP1-AS1高表達組和低表達組患者術后5年生存情況

臨床病理特征 單因素分析風險比 (95% CI)P值 多因素分析風險比 (95% CI)P值年齡 (<50、≥50歲) 1.012(0.687～1.948)0.274 1.744(0.954～3.221)0.079性別 (男、女) 0.974(0.559～1.542)0.304 0.908 (0.586～1.702)0.322腫瘤直徑 (<4、≥4 cm) 1.545(0.864～2.889)0.136 1.245(0.745～2.351)0.214AFAP1-AS1表達水平 (低、高) 2.591(1.349～4.921)0.009 2.446 (1.334～4.647)0.012組織學分級 (I～II、III～IV) 2.312(1.297～4.507)0.014 2.864(1.502～5.554)0.003KPS評分 (低、高) 2.030(1.102～3.931)0.020 2.987(1.599～5.846)0.001術后復發 (是、否) 2.161(1.201～4.014)0.018 2.543 (1.397～4.886)0.010

討論

LncRNAs通常被認為是一種轉錄副產物，沒有蛋白質編碼能力。但越來越多的證據表明lncRNAs廣泛參與了各級基因表達的調控, 在染色質修飾、轉錄和轉錄后處理等多種類型的生物過程中起到重要作用，是目前遺傳學研究的熱點[19]。近幾十年來, 據報道, 在致癌過程和癌癥進展中，經常觀察到反常表達的lncRNAs，這表明失調的lncRNAs可能作為早期癌癥診斷的新的生物標志物，可以作為惡性腫瘤的有效治療指標和預后預測靶點。例如, lncRNA HULC和lncRNA ZFAS1的高水平表達都可以促進肝細胞癌(HCC)的發生和轉移[20]。而AFAP1-AS1作為AFAP1反義鏈上的 lncRNA，研究證明其可能通過影響 AFAP1對生理病理進程的調控，在分子機制上影響肌動蛋白與其它蛋白的連接，進而影響細胞的吞噬、運動及腫瘤的侵襲和轉移[21]。Zhang等[22]發現在舌鱗癌組織中，AFAP1-AS1的表達明顯高于癌旁組織，在沉默AFAP1-AS1的表達后，舌癌細胞的增殖能力減弱，且細胞周期阻滯。此外Lu等[23]發現，AFAP1-AS1在肝癌組織中的表達上調，而且其高表達與腫瘤直徑、血管浸潤、臨床TNM分期和預后有關，說明AFAP1-AS1在肝癌的進展中發揮著致癌基因的作用。但是，AFAP1-AS1在不同級別膠質瘤中的表達量和對患者臨床預后的作用卻沒有相關科研報道。

在我們的研究中，我們檢測到AFAP1-AS1在膠質瘤組織和正常腦組織中的不同表達水平，發現相較于正常腦組織，AFAP1-AS1在膠質瘤組織中呈高水平表達，這提示我們AFAP1-AS1可以影響膠質瘤的發展和進展。接下來我們探討AFAP1-AS1與膠質瘤臨床病理特征及預后的關系，發現AFAP1-AS1過表達與KPS評分以及是否復發有關，并且也與WHO分級呈正相關。而與患者年齡、性別以及腫瘤直徑等均無關。因此, 我們推測高表達AFAP1-AS1在膠質瘤中可加速腫瘤生長, 增強局部細胞侵襲和轉移, 調節細胞分化。最后根據我們的隨訪數據，AFAP1-AS1高表達組患者的5年生存率要明顯低于AFAP1-AS1低表達組。同時我們的研究證實AFAP1-AS1在腫瘤組織中的高表達、高病理級別、KPS評分<80分以及術后復發等均可作為評價膠質瘤患者不良預后的獨立因素。

綜上，本研究中我們證實了AFAP1-AS1在神經膠質瘤組織中的表達水顯著增高，而高表達水平的AFAP1-AS1與膠質瘤患者的不良臨床預后有關，可作為預測膠質瘤患者術后預后的獨立因素和膠質瘤診斷的新的生物標志物。在未來，需要有更多的研究來驗證AFAP1-AS1作為可靠的臨床預測指標對于膠質瘤患者預后的作用。同時AFAP1-AS1在神經膠質瘤發生發展過程中的具體作用機制，以及可能參與的傳導通路及分子作用靶點，也需要我們進一步深入研究。