骨髓增殖性腫瘤患者發生血栓事件的危險因素*

郭曉波，楊 樂，藺 京，龔衛鋒，楊瑞利，史 敏

1.西安市中心醫院(西安 710003)；2.西安長安醫院(西安710018)；3.西安培華學院醫學院(西安710061)

骨髓增殖性腫瘤(Myeloproliferative, MPN)包括真性紅細胞增多癥，原發性血小板增多癥和原發性骨髓纖維化是起源于造血干細胞水平的克隆性血液惡性腫瘤。MPN發病機制的核心是由于影響JAK2，CALR或MPL的驅動突變家族的JAK / STAT信號傳導途徑的組成活化，炎癥因子被活化后可以引起紅系、巨核系異常增殖，網狀纖維異常增生，膠原蛋白過度沉積，從而又引發外周血細胞過度增生，骨髓纖維化和髓外造血等臨床表現[1]。這些疾病發病較為隱匿，進展緩慢，患者早期可能無任何臨床癥狀，僅在做血常規檢查時偶然發現，其具有共同的臨床和實驗室特征，是一系或多系統血細胞增多，肝脾腫大，有出血和血栓形成，發生動脈和靜脈血栓形成事件的風險增加以及進展為骨髓纖維化和急性白血病的可能性，并且以血栓性并發癥的高發生率而聞名[2]。一些研究表明MPN發生血栓性并發癥與JAK2-V617F突變有很大的相關性[3]。本研究主要對MPN血栓事件發生率與JAK2-V617F等一些臨床指標進行分析，探討引發血栓事件的危險因素，為臨床提供有益幫助。

資料和方法

1 一般資料 所有病例均來自本院就診住院MPN患者，其中男195例，年齡15～72歲，平均年齡56歲；女196例，年齡16～60歲，平均年齡48歲。391例病例的診斷均符合最新WHO關于骨髓增殖性腫瘤的分類和診斷的標準[4]。

2 儀器與試劑 JAK2-V617F采用美國伯樂CFX96實時熒光定量PCR儀，RNeasy Plus Mini Kit提取試劑盒購自德國GIAGEN公司，融合基因試劑盒(JAK2-V617F)購自上海源奇生物醫藥科技股份有限公司。血細胞分析儀采用邁瑞BC-5800，試劑為其公司試劑。

3 檢測方法

3.1 血常規外周血采集：所有對象從肘正中靜脈抽取靜脈血2ml置于EDTAK2抗凝管中，立即混勻，室溫2 h內進行測定。標本測定前需用標準血漿對血細胞儀進行室內質量控制，要求在控。在本研究當之中主要是針對白細胞計數、血小板計數以及血紅蛋白濃度值進行了對比分析。

3.2 JAK2-V617F融合基因標本采集和檢測：采集患者外周血5.0m加入EDTAK2作為抗凝劑的一次性試管中，顛倒混勻，通過紅細胞裂解液除去標本中的紅細胞(紅細胞破裂，液體呈紅色透明狀)，獲得白細胞，進而裂解白細胞和去除蛋白，用RNA提取試劑從中獲得RNA。將混有引物和熒光探針等物質的PCR反應液與酶混合，震蕩混勻5～10 s，在迷你離心機快速離心，從而將管壁和蓋子上的液體甩至管底。將上述液體放于PCR八連管中，隨后將提取好的樣本、內參、陰陽對照、標準品分別加入對應管內，蓋緊管蓋、將其移至檢測區。反應管置于實時熒光定量PCR儀上，按實際說明書要求設置相應的循環參數：45℃×5min→95℃×3min，再按94℃×15s→60℃×60s，循環40次；單點熒光檢測在60℃；檢測通道為FAM通道。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定性分析，一般的Ct值可選擇在全部擴增曲線的第一個明顯拐點前2～3個Ct值，設定3～15個循環的平均熒光信號為基線(圖1)。全部實驗操作過程均嚴格按照試劑說明書和實驗室操作規范進行，同時做質量控制，所有的結果均在實驗室質量控制范圍內。

注：Amplification為擴增曲線，Cycles為循環數，Log Scale為對數范圍

3.3 血栓性事件調查 通過經驗豐富的臨床醫師對患者進行既往病史調查，詳細詢問并且記錄每一位患者既往有無心、腦血栓性疾病以及出現和MPN擬診相關臨床征象后的深靜脈血栓形成和心、腦梗死等血栓性事件發生的情況。

4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件分析處理數據，計數資料用[例(%)]表示，計量資料比較采用χ2檢驗。以發生血栓事件為因變量，各項記錄指標為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 MPN血栓事件發生率的情況 391例MPN患者中105例發生血栓事件，血栓發生率為26.9%(105/391)。血栓發生率在男女性別之間差異無統計學意義(χ2=0.59，P>0.05)；而年齡≥45歲的患者高于年齡<45歲的患者，差異有統計學意義(χ2=16.81，P<0.05)；JAK2-V617F陽性的患者高于陰性患者，差異有統計學意義(χ2=23.59，P<0.05)；外周血白細胞數量≥10×109/L的患者高于白細胞<10×109/L的患者差異有統計學意義(χ2=28.3，P<0.05)；外周血血小板數量≥300×109/L的患者高于血小板數量<300×109/L的患者，差異有統計學意義(χ2=29.14，P<0.05)；外周血血紅蛋白含量≥160g/L的患者高于血紅蛋白含量<160g/L的患者，差異有統計學意義(χ2=30.58，P<0.05)。見表1。

表1 MPN血栓事件發生率情況

2 Logistic回歸分析 采用多因素Logistic回歸分析方法，以年齡、性別、白細胞、血小板、血紅蛋白、JAK2-V617F陽性為自變量，以血栓為因變量，結果顯示：高齡、高白細胞計數、高血小板計數、高血紅蛋白含量、JAK2-V617F突變陽性是血栓事件發生的危險因素，見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析結果

討論

骨髓增殖性腫瘤患者的整個發病的過程中出現的所有并發癥以及繼發血液系統癌癥,是對這一類患者的生存質量有非常大的影響。由于這一類患者外周血中的細胞增殖速度過快、量過高，以至于引起外周血液粘稠、淤滯，進而又引起心腦血管方面的各種疾病，心腦血管血栓和出血事件是這一類患者出現并發癥以及于導致此類患者死亡的最主要原因之一。2016年新的骨髓增殖性腫瘤診斷標準中，JAK2-V617F基因突變檢測被納為診斷標準之一，真性紅細胞增多癥患者JAK2-V617F基因突變的檢出率為90%～95%，原發性血小板增多癥患者JAK2-V617F基因突變的檢出率為50%～70%，原發性骨髓纖維化患者JAK2-V617F基因突變的檢出率為40%～50%。JAK2-V617F基因突變不僅與骨髓增殖性腫瘤的發生、發展有關，而且與其并發癥和預后也有很大關系，有研究表明，JAK2-V617F基因突變可以增加費城染色體陰性MPN患者心血管并發癥的風險[5]。同時也有研究表明JAK2-V617F突變與血栓事件的發生率之間存在顯著的相關性，JAK2-V617F內皮細胞有促炎癥和促血栓表型和功能上都是親粘附，提示這些突變可能在血栓形成中發揮作用[6-8]。Lamy M等國外研究者在其研究結論中，認為篩選在CVT患者JAK2 -V617F突變似乎即使沒有明顯的MPN和/或由于其患病率比較高的其他危險因素CVT的存在和血栓復發的危險性是有益的[9]。

本文從MPN患者性別、年齡、JAK2-V617F、外周血常規方面，分別比較其血栓事件的發生率，結果顯示MPN患者男女性別之間，差異無統計學意義，而高年齡、JAK2-V617F陽性、高白細胞數量、高血小板數量、高血紅蛋白含量的患者更易出現心腦血管血栓事件。本研究還進一步通過回歸分析顯示，高年齡、高白細胞計數、高血紅蛋白含量、高血小板計數、JAK2-V617F突變等因素與MPN發生血栓事件有關，是發生血栓事件的危險因素。此次研究結果中，JAK2-V617F陽性患者血栓發生率為80%，陰性患者血栓發生率為20%，兩組間比較差異有統計學意義，這一結果與土耳其研究者Andlc Neslihan 的研究結果有相似之處[10]。國內研究者吳鴻飛等[11]人回顧性分析了115例bcr-abl陰性的骨髓增殖性腫瘤患者初診時的臨床特征和實驗室指標，最終認為JAK2-V617F陽性、高HB水平、高血壓、高齡是發生血栓的危險因素，這一結果中有些觀點與本文研究結論相一致。

血栓是骨髓增殖性腫瘤患者主要致死和致殘的原因之一，所以預防和治療血栓發生是治療這一類疾病的主要目的。目前臨床上主要的治療方法有小劑量阿司匹林降低原發性真性紅細胞增多癥和原發性血小板增多癥患者的血栓發生，針對原發性真性紅細胞增多癥的放血療法，羥基脲、干擾素α降低血細胞的方法。對于原發性血小板增多癥的患者可以適當的采用抗凝劑藥物治療來防止血栓的發生。原發性骨髓纖維化患者主要是激素、沙利度胺、骨化三醇、糾正其貧血等手段為主，如遇到早期血細胞高的患者可以加羥基脲進行治療[12]。近年來JAK2抑制劑[13-14]等一些新型靶向藥物的研究有望對JAK2-V617F陽性的患者帶來更多選擇和新的曙光。對于本研究當中引發骨髓增殖性腫瘤患者血栓事件的危險因素，臨床及早的采取一些預防和治療措施，可以幫助患者提高生活質量和延長生存期。

綜上所述，血栓形成在癌癥患者中很常見，并與發病率和死亡率增加有關，骨髓增生性腫瘤(MPN)最重要的并發癥是血栓栓塞事件，因此預防血栓形成事件是目前這些疾病治療的主要目標。年齡較高、JAK2-V617F陽性、血細胞升高的MPN患者容易出現血栓事件，是其發生血栓事件的危險因素，提示臨床對于這些指標的變化應該引起高度重視，及早采取預防措施。