人前列腺間充質干細胞在不同培養條件下體外誘導分化能力的初步研究

張戈垚 黃翔華

【摘要】間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于人體發生、發育過程的許多種組織中，前列腺中也存在MSCs。體外分離培養MSCs所采用的體系一般分為無血清培養體系和有血清培養體系。本研究選取常規無血清MSCs培養液和MEMɑ+10%MSCs金牌血清培養液這兩種培養體系同時培養人前列腺間充質干細胞（human prostate-derived? mesenchymal stem cells，hPMSCs），觀察培養后的人前列腺間充質干細胞誘導分化能力的差異，從而推測有無血清的培養體系對人前列腺間充質干細胞的影響。研究結果表明，與無血清間充質干細胞培養液比較，MEMɑ+10%間充質干細胞金牌血清培養液中的人前列腺間充質干細胞體外分化能力完全，符合間充質干細胞分化能力標準。本研究結果為臨床和實驗室科研選用適宜的培養體系提供了初步的依據。

【關鍵詞】人前列腺間充質干細胞;培養條件;分化

【中圖分類號】R181.3+2【文獻標志碼】A【文章編號】1005-0019（2019）02-004-02

1研究背景

1.1人前列腺間充質干細胞簡介

近年來研究發現，在機體的大多數器官中均具有MSCs，具有較強的細胞增殖和多分化潛能，在組織器官的損傷修復中有重要的作用[1]。良性前列腺增生包含腺體和間質組織增生，正常前列腺的間質細胞與皮質細胞比例為2：1，在前列腺增生組中，間質細胞與皮質細胞之比升高為5：1，隨著年齡增加，細胞增殖能力大大降低[2，3]。目前，我們能夠從肌肉、骨髓、肺、脂肪、肝、胰腺等組織以及臍帶血、羊水中制備MSCs[1]。有研究發現在前列腺中也存在MSCs，有關它們的分化能力罕有報道[4]。

1.2MSCs體外分化能力和鑒定

體外分離培養MSCs所采用的體系一般包括有血清和無血清培養體系，前者為醫用級MSCs采用，后者多為實驗室研究級MSCs采用[5，6]。

MSCs在體外特定條件下可分化為多種中胚層來源的細胞[7]。通過對定向分化細胞的檢測來確定MSCs在不同培養基中分化能力是否存在差異[8-10]。

油紅O染料（Oil Red-O）屬于蘇丹染料家族的一員，是一種脂溶性的偶氮染料[11]。由于在成脂分化作用下，間充質干細胞會先后誘導分化為前成脂細胞和脂肪細胞，后者聚集著大大小小的脂肪滴，油紅O在脂肪中的溶解度大于其在染液中的溶解度，因而使脂肪著色，呈現紅色或橘紅色。

茜素紅S（Alizarin Red S）是一種常用示鈣染劑，廣泛用作生物醫學樣本中含鈣目標物的染色檢驗。游離的鈣離子可與茜素紅S形成紅色沉淀，固著的鈣則會被直接染成紅色。在成骨誘導分化作用下，間充質干細胞會被逐漸分化為骨細胞，包括鈣化骨節（鈣鹽結晶體）的形成和細胞的泌鈣反應，兩者均可被茜素紅S染成紅色。

阿爾新藍8GX（Alcian Blue 8GX）是阿爾新藍家族的一種，廣泛用于酸性多糖的染色，例如軟骨或其他組織中的糖胺聚糖以及細胞分泌的外被多糖等。在軟骨誘導分化作用下，間充質干細胞會被誘導成為軟骨細胞。軟骨細胞外具有一層富含蛋白多糖的基質，是軟骨分化的標志物，可被阿爾斯新藍染成藍色或藍綠色。Alcian Blue染色是成熟軟骨細胞的標志。

2研究目的和意義

2.1研究目的

實驗室細胞培養用血清成分不確定，因血清品質和添加量不同，其中的因子對MSCs的影響有差異。市場銷售的間充質干細胞成品培養液多為無血清培養液，成分明確，但適用細胞類型有限。本研究選取Biological Industries公司出品的常規無血清間充質干細胞培養液和MEMɑ+10%間充質干細胞金牌血清培養液這兩種培養體系，觀察分離且鑒定過的hPMSCs誘導分化能力的區別，從而推測有無血清對hPMSCs的影響。

2.2研究意義

干細胞是一類有自我更新和多分化潛能的細胞，在特定條件下，它們可轉變為一種或多種細胞。有關人類MSCs的研究最終的目標均是希望應用于臨床。目前間充質干細胞已經在解決多種疾病方面有重大突破。但是考慮到動物血清的臨床使用風險，市場提供的成品培養液均是無血清產品，這些產品適用MSCs類型有限，為滿足多種類型MSCs的臨床研究需要，我們必須要關注新型間充質干細胞在使用常規有血清和無血清培養體系中的分化差異，該類比較研究未見報道。

3材料與方法

3.1材料與試劑

建系的人間充質干細胞由內蒙古自治區人民醫院泌尿外科研究所提供，MEMɑ基礎培養液、間充質干細胞金牌血清、MSC NutriStem XF成品培養液、成脂誘導分化液、成骨誘導分化液、成軟骨誘導分化液、成脂分化染色液試劑盒、成骨分化染色液試劑盒、成軟骨分化染色液試劑盒、MSC Attachment solution均由Biological Industries公司提供。

3.2儀器與設備

15ml離心管、50ml離心管、24孔細胞培養板（均購自Corning公司）;細胞培養箱（Thermo公司）、1000μl移液器、無菌注射器、0.22μm無菌濾器、倒置顯微鏡（Nikon）、超凈工作臺、冰箱

3方法

（1）hPMSCs誘導分化培養基的配制

①成脂分化完全培養基的配制：

室溫下解凍2 個Supplement Mix（Mix I 和Mix II），將0.1 ml Supplement Mix I 與 1.5 ml Supplement Mix II 加入到100 ml Adipogenic Basal Medium 中，即為誘導成脂分化完全培養基。該完全培養基可在2-8°C 儲存一個月。

②成脂分化完全培養基的配制：

MSC go Osteogenic XF是即用型完全培養基。

③成軟骨分化完全培養基的配制：

室溫下解凍Supplement Mix，將Supplement Mix 和Chondrogenic Basal Medium 以1：10 的比例混合即為完全分化培養基（如：10 ml Supplement Mix + 100 ml Basal Medium）。

該完全分化培養基可在2-8°C儲存一個月。

（2）接種hPMSCs：

用MSC Attachment solution （BI： 05-752-1，1：100 DPBS 稀釋使用） 預包被一個24孔細胞培養板18孔，其中9孔加入1 ml/孔 MSC NutriStem XF成品間充質干細胞無血清培養液，接種0.75x105 細胞。剩余9孔加入1 ml/孔MEMɑ基礎培養液+10%間充質干細胞金牌血清的混合液，接種0.75x105細胞。將24孔細胞培養板放于37°C，5% CO2培養箱中。培養24 h 后，當細胞融合度達到80-90%時，分別將MSC NutriStem XF 培養基和MEMɑ基礎培養液+10%間充質干細胞金牌血清的混合液吸除。每3孔細胞分為一組，每種培養液體系各有3組，這3組分別加入1ml/孔成脂分化培養基、成骨分化培養基和成軟骨分化培養基。將24孔細胞培養板置于37 °C，5% CO2培養箱中培養14-21天，期間每3天換液一次。

（3）hPMSCs分化的染色鑒定

①成脂誘導分化染色鑒定

（A）染色前，將Adipo-Staining A與Adipo-Staining B （C37A40010） 按3：2的體積比混合，即為染色工作液（Staining Solution）。每次使用現用現配，3 小時內使用。

（B）吸棄分化培養基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A）輕輕潤洗培養瓶底面

（C）吸棄DPBS，加入3 ml Adipo-Fixation （C37A10020），輕輕晃動培養瓶，使底面浸潤均勻，室溫下靜置30 分鐘。

（D）吸棄Adipo-Fixation，加入3 ml Adipo-Wash I （C37A20050），潤洗底面，靜置2-3min

（E）吸棄Adipo-Wash I，加入3 ml Staining Solution使底面浸潤均勻，室溫下靜置30 min。

（F）吸棄Staining Solution，加入3mlAdipo-Wash II （C37A50050），

（G）吸棄Wash II，重復（F），再次漂洗細胞（如若上清依然很紅，可延長漂洗時間或再漂洗一次）。

（H）加入1 ml Adipo-Inspection（C37A60010），置于顯微鏡下觀察、拍照

②成骨誘導分化染色鑒定

（A）吸棄分化培養基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A） 輕輕潤洗培養瓶底面

（B）吸棄DPBS，加入3 ml Fixation solution（C37C10020），輕輕晃動培養瓶，使底面浸潤均勻，室溫下靜置30 分鐘

（C）吸棄Fixation solution;加入3 ml Wash I （C37C20050），潤洗細胞2-3 次

（D） 吸棄Wash I，加入3 ml StainingSolution （C37C30020），底面浸潤均勻，室溫染色30 分鐘

（E）吸棄Staining Solution，加入3 ml Wash II （C37C40050），潤洗細胞2-3 次

（F）吸棄Wash II，加入1 ml Inspection Solution（C37C50010），置于顯微鏡下觀察、拍照（細胞會被染成橘紅色）。

③成軟骨誘導分化染色鑒定

（A）吸棄分化培養基，加入1 ml DPBS （BI 02-020-1A） 輕輕潤洗培養瓶底面。

（B）吸棄DPBS，加入3 ml Fixation solution （C37B10020），輕輕晃動培養瓶，使底面浸潤均勻，室溫下靜置30 分鐘。

（C） 吸棄Fixation solution，加入3 ml Wash I （C37B20050），潤洗細胞，靜置2-3 分鐘

（D）吸棄Wash I，加入3 ml Staining Solution （C37B30020），底面浸潤均勻，室溫避光染色過夜

（E）吸棄Staining Solution，加入3 ml Wash II （C37B40050），潤洗細胞。

（F）吸棄Wash II，重復第5 步，再次漂洗細胞（如若上清依然很藍，可延長漂洗時間或再漂洗一次.注意：不要把細胞沖下來）。

（G）加入1 ml Inspection Solution（C37B50010），置于顯微鏡下觀察、拍照。

4結果分析

在MSC NutriStem XF無血清培養液中培養的人前列腺間充質干細胞誘導分化后，成脂分化結果未見紅色油脂滴形成;成骨分化偶見茜素紅S形成的紅色沉淀;成軟骨分化可見藍綠色結構（圖1）。這提示MSC NutriStem XF無血清培養液中培養的人前列腺間充質干細胞體外成脂分化有障礙。相較而言，在 MEMɑ基礎培養液+10%間充質干細胞金牌血清中培養的人前列腺間充質干細胞誘導分化后，可見紅色油脂滴形成，說明成脂分化成功;成骨分化可見大量的茜素紅S形成的紅色沉淀;成軟骨分化可見明顯藍綠色結構（圖2）。這說明該體系培養的人前列腺間充質干細胞體外分化能力完全，符合間充質干細胞分化能力標準。雖然這一體系含有血清，但該體系培養的人前列腺間充質干細胞性質穩定。

5討論

5.1創新

截至目前，未見有關比較人前列腺間充質干細胞在有血清和無血清培養體系中培養后體外誘導分化能力比較的報道。分析這一分化能力的差異，可為臨床和實驗室科研挑選適宜的維持人前列腺間充質干細胞性質穩定的培養體系提供實驗依據。比起人血清的風險，更應該注重細胞性質的穩定。

5.2展望

本項研究僅簡單探討了不同培養體系中人前列腺間充質干細胞體外誘導分化能力的差異，并未深入引起這種差異的的深層次原因。今后我們將分析引起這種差異的關鍵基因或蛋白質，為臨床和科研需求提供更為詳盡的研究基礎。

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