應用流式細胞術檢測結核分枝桿菌藥敏試驗

陳天剛 胡永芳

【摘要】目的：建立流式細胞術檢測結核分枝桿菌藥敏試驗的方法。方法：利用結核分枝桿菌水解HDA的特點，選取HDA作為帶有熒光的材料。應用流式細胞術檢測20株結核分枝桿菌對RFP，INH，SM和EMB的敏感性。MI值由不同濃度藥物影響細菌后培養物檢測到的平均熒光強度與陽性對照的比值來推斷[1]：20株結核分枝桿菌的流式細胞儀藥敏試驗結果與比例法基本一致。結論：建立流式細胞術檢測結核分枝桿菌藥敏具有快速、準確、簡便等優點，可用于臨床結核分枝桿菌藥敏的檢測。

【關鍵詞】結核分枝桿菌;微生物敏感性試驗;流式細胞術

【中圖分類號】R378.911【文獻標志碼】A【文章編號】1005-0019（2019）02-056-01

結核病是一種嚴重危害人類健康的傳染病。近年來，世界上結核病的發病率明顯增加，中國也不例外。在結核病控制過程中，結核分枝桿菌的耐藥性，尤其是耐多藥結核分枝桿菌的耐藥性，已成為結核病預防工作的嚴重障礙。耐多藥結核分枝桿菌（MDR-TB）與非標準臨床治療密切相關，需要快速、靈敏的藥物檢測方法。建立結核分枝桿菌快速藥敏試驗是有效控制結核病的重要方法。目前，比例法已廣泛應用于國內各實驗室進行分枝桿菌的藥敏試驗。這種方法在分離菌株后獲得藥敏試驗結果需要四周的時間。在二十世紀八十年代建立的BACTECTB 460分枝桿菌檢測系統基礎上開發的BACIECMG TI960可縮短獲得藥敏試驗結果的時間到5-8天，但存在要求特殊儀器、試劑比較昂貴、有一定的污染率等缺點。近年來，隨著流式細胞儀器在醫院中的普及，流式細胞術在細菌藥敏試驗中的應用得到了很大的發展。細菌與熒光染料的結合程度可判斷細菌的活性?？焖偎幬锩舾行栽囼灳哂兄匾饬x。應用流式細胞術檢測結核分枝桿菌藥敏試驗已取得一定進展。然而，中國卻沒有媒體報道這一點[2]我們對此進行了研究。研究過程和結果如下：

1材料

1.1 菌株 結核分枝桿菌H37Rv標準株，以及于2018年1月至2018年2月在重慶市公共衛生醫療救治中心分枝桿菌實驗室采集到的臨床分離株，鑒定出20株結核分枝桿菌，其中10株為耐多藥結核分枝桿菌（MDR-TB）。

1.2試劑? 利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、乙酰乙酸熒光素和IMSQ均購自Signa，7H9液體培養基購自美國BD公司。FDA溶于DMSO，配置為1g/L的溶液，儲存在-20C。

1.3儀器? 流式細胞儀為BD FACSCalibur型號，是美國BD公司制造的。

2方法

2.1 標準菌株的藥敏試驗? 在羅氏培養基上挑取H37Rv標準菌株的菌落，在含有玻璃珠的無菌瓶中磨成干酪樣品。用生理鹽水制備1g/L菌懸液。將1 g/L菌懸浮液稀釋至10-2 g/L細菌提取物Q1MI，接種到含有不同濃度藥物的7H9液體培養基中。INH的最終濃度為1.25、2.5、5、10、20mg/L，RFP為1.25、2.5、5、10、20mg/L，SM為2、4、8、16、32mg/L，EMB為0.625、1.25、2.5、5、10mg/L，7 H9培養基為空白對照。然后將8%多聚甲醛添加到FDA37℃培養30min，用流式細胞術來確定最終和平均熒光強度。

2.2臨床菌株的藥敏試驗? 根據標準菌株藥敏試驗，篩選出檢測臨床菌株的最佳實驗方案。將20株臨床分離的結核分枝桿菌接種于含不同藥物濃度的7H9液體培養基中，最終INH濃度為2.5、5、10mg/L，RFP為5、10、20mg/L，SM為8、16、32mg/L，EMB為1.25、2.5、5 mg/L，在37℃培養72h，分別加入終濃度為250Lg/L的FDA 37℃孵育30min， 加入8%多聚甲醛處理40min，用流式細胞儀測定細菌的平均熒光強度。

2.3流式細胞儀檢測? 首先，利用熒光微球對儀器的光路和液體流動系統進行標定，確保儀器各項指標均在允許范圍內，并將前角（FSC）和側角（SSC）的信號值設定為對數a。美化。根據FSC/SSC的信號調節電壓，以發現最集中的細菌。通過直方圖計算FDA在FL通道上的平均熒光強度（MF I），最低抑菌濃度（MIC）。通過比較藥物管與不含藥物的陽性對照管的MF的60%或更多來確定。

2.4比例法檢測結核分枝桿菌的藥敏試驗? 參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》91操作。

2.5統計分析? 使用? SPS91.0統計軟件進行分析，配對資料采用X2檢驗，RQ05為差異有統計學意義。

3結果

流式細胞術檢測不同時間的對照結果，可以看出培養時間為72個小時最為適宜，在流式細胞術檢測臨床株的藥敏試驗結果與絕對濃度法結果比較上，我們可以發現通過這兩種方法檢測的結果沒有差別。

4討論

FDA是一種無極性、無熒光酯，本身不發熒光，滲入活細胞后，可被胞質中的酯酶迅速水解釋放出熒光素，在488mm的藍光激發下，發射出黃綠色的熒光，可經流式細胞儀檢測。? 利用FDA的特點，使之與結核分枝桿菌作用，該物質能穿透活的分枝桿菌細胞壁并能被胞質中的非特異性酯酶迅速水解為游離的熒光素，而死菌和被抗結核藥物抑制的細菌因缺乏活性酯酶而不能有效地水解FDA游離熒光素產生會相應減少，通過流式細胞儀檢測帶熒光的分枝桿菌的熒光強度的變化來推斷MIC獲得藥敏試驗結果[3]首先建立了結核分枝桿菌標準菌株H37R的流式藥敏試驗方法，藥物和細菌作用后我們可以得到結果，結果和狀態或與樣品的處理有關。在試驗過程中為防止實驗室污染，保證操作者的安全，上樣前對樣品用8%的多聚甲醛處理，使結核桿菌失活，但發現甲醛的處理后會使部分試驗管的熒光強度有所降低，在一定程度上影響了試驗結果，這一問題還有待解決。

5結語

結核分枝桿菌細胞學敏感性試驗簡便、快速、靈敏、重復性好。如果它被發展成一套成熟的方法，它可以作為一個常規的臨床試驗來執行。因此，結核分枝桿菌藥物敏感性實驗的快速檢測，從28天到2-3天，一方面有利于結核病的治療，另一方面也能及時發現耐多藥結核患者，減少結核患者的傳播。

參考文獻

[1]李慶炎.翟志敏.流式細胞術用于念珠菌快速藥敏試驗的研究[J]中國臨床保健雜志201 10（2） 1227-1229.

[2]馬筱玲，李志敏.流式細胞術檢測抗生素最低抑菌濃度[J]中華微生物學和免疫學雜志，2016（4）3639-3645.

[3]夏曉華，泉.流式細胞術應用于金黃色葡萄球菌體外藥敏試驗的初步研究[J]中國人獸共患病雜志，20164）5053-5058.