廣州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性變異株監測與基因進化分析

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禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，根據病毒粒子表面抗原血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同，分為不同亞型：H1～H16，N1～N9[1-2]。禽流感病毒通常感染禽類，引起動物隱性感染、發病或死亡。我國自1997年開始，先后出現了H5N1、H9N2、H5N6、H6N1、H7N9、H10N8等人禽流感病毒感染病例[3-5]，對我國的公共衛生造成了重大危害。2013年我國首次出現人感染H7N9 禽流感疫情[6]，截至目前廣州市累計報告人感染H7N9禽流感病例共計43例。2017年首次從廣東2例人感染H7N9病例分離到高致病性H7N9禽流感病毒[7]，這是H7N9禽流感病毒自感染人以來，出現的重要基因變異。本研究對2017年10份人感染H7N9禽流感病毒陽性標本進行基因序列測定，分析當前本地區H7N9高致病性變異株重要蛋白變異情況和遺傳進化特點，為廣州地區人感染H7N9禽流感的科學防控提供研究數據。

1 材料與方法

1.1標本來源 采集2017年具有禽類接觸史的流感樣病例、不明原因肺炎病例的咽拭子標本進行H7N9禽流感病毒檢測，陽性標本經廣東省疾病預防控制中心復核確認，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2核酸檢測 采用實時熒光定量RT-PCR方法對標本進行病毒核酸檢測，參照試劑盒使用說明書，分別進行H7亞型和N9亞型禽流感病毒檢測。病毒核酸提取試劑盒和禽流感病毒H7N9檢測試劑盒(熒光定量PCR法)分別購于QIAGEN公司和江蘇碩世生物科技股份有限公司。

1.3序列測定 應用Oligo 6軟件設計H7N9禽流感病毒HA、NA和M基因全長擴增引物，見表1，引物由華大基因合成。采用一步法RT-PCR反應擴增目的基因片段，將電泳鑒定的陽性擴增產物送至英濰捷基公司，通過ABI 3730進行病毒一代測序。

表1 H7N9禽流感病毒HA、NA和M基因全長擴增引物Tab.1 Gene amplification primers of avian influenza A(H7N9) viruses

1.4基因特征分析 應用DNA Star 7.1軟件拼接HA、NA和M基因序列并對序列進行同源性分析。從NCBI下載廣東、浙江、安徽、江蘇、臺灣、江西等地人源、禽源和環境H7N9不同片段基因作為參比序列。采用MEGA 4.0軟件，以基因開放閱讀框為基本單元，繪制HA、NA和M1基因系統進化樹，分析病毒的流行進化特點。繪制方法為Neighbor-joining法(參數設置為1000 replications)及Maximum composite likelihood model比對核苷酸序列。用MegAlign軟件對重要蛋白位點進行基因插入、缺失和突變分析。

2 結 果

2.1同源性分析 10份毒株的HA基因核苷酸同源性在95.1%～99.2%之間，氨基酸同源性在93.6%～99.1%之間。NA基因核苷酸同源性在95.6%～99.6%之間，氨基酸同源性在93.8%～99.4%之間。M1基因核苷酸同源性在95.9%～100%之間，氨基酸同源性在98.4%～100%之間。不同基因片段最大相似度毒株見表2。

2.2分子特征 對2017年10株H7N9禽流感病毒基因測序發現，有5株病毒HA蛋白裂解位點為PKRKRTAR↓GLF，含有連續4個堿性氨基酸插入，呈現高致病性禽流感病毒分子特點。所有病毒的受體結合位點均出現G186V變異，其中有5株病毒出現Q226L變異。所有毒株在HA蛋白的毒力位點均出現D225G變異，詳見表3。HA蛋白上第30、46、249、421、493位氨基酸上的糖基化位點分別為NGT、NAT、NDT、NVT、NNT，其中2017XN09919病毒在136位增加了糖基化位點NGT。NA蛋白頸部69-73位均發生了氨基酸缺失，NA蛋白主要在42、52、63、66、87、147、202上有7個潛在糖基化位點，而2017XN01746在52位出現糖基化位點缺失，2017XN07751和2017XN29043在63位點出現缺失，而2017XN00096和2017XN27043分別在346和459位點增加了糖基化位點NNS和NWS。NA蛋白對神經氨酸酶抑制劑耐藥的119、120、152、229、245、276、294位點上，有2株病毒分別出現E120K和R294K突變，詳見表4。M1蛋白毒力相關位點上，所有毒株均出現N30D和T215A突變。M2蛋白烷胺類藥物耐藥位點上，所有毒株出現了S31N突變，另有3株出現V27G突變，詳見表5。

表3 HA蛋白裂解位點、受體結合位點、毒力位點變異情況 Tab.3 Mutations of amino acid sites in HA protein

表4 NA蛋白頸部缺失、耐藥位點變異情況Tab.4 Mutations of amino acid sites in NA protein

表5 M1蛋白毒力位點、M2蛋白耐藥位點突變情況Tab.5 Mutations of amino acid sites in M1 protein

2.3遺傳進化分析 對2017年廣州地區10株人感染H7N9禽流感病毒遺傳進化分析發現，5株高致病性變異株的HA基因與與廣東、江西分離株親緣關系較近，歸屬于同一進化分支，屬于華南分支，另5株非變異株與上海、江蘇、浙江分離株親緣關系較近，歸屬于同一遺傳進化分支，屬于華東分支，見圖1。NA遺傳進化特點與HA較為相似，即高致病性變異株均屬于華南分支，詳見圖2。M1基因主要集中在3個不同的進化分支，其有2株高致病性變異株與華南地區H7N9禽流感病毒親緣關系相近，屬于同一進化分支，另3株高致病性變異株與北方H7N9禽流感病毒親緣關系相近，歸屬于同一進化分支。非變異株分別于華南H9N2病毒和北方H7N9病毒親緣相近，歸屬于相應分支，見圖3。

注：“●”為高致病性H7N9禽流感病毒，“■”為低致病性H7N9禽流感病毒，紅色字體為達菲耐藥株

注：“●”為高致病性H7N9禽流感病毒，“■”為低致病性H7N9禽流感病毒，紅色字體為達菲耐藥株

注：“●”為高致病性H7N9禽流感病毒，“■”為低致病性H7N9禽流感病毒，紅色字體為達菲耐藥株

3 討 論

2013 年第一次H7N9 疫情從華東地區開始直至全國多個省出現感染病例[8]，2013 年3月-2017年3月的5次季節性高發疫情都主要集中在我國東南沿海地區[9]。H7N9 的發病高峰期主要集中在冬、春季節，可能是因為氣溫較低的環境更適合該病毒的生存[10]。廣州地區外環境長期監測數據顯示[11]，廣州市禽類市場普遍存在H7N9禽流感病毒污染，尤其以冬春最為嚴重，2017年廣州市共計檢出H7N9禽流感病例16人，發病時間均集中在2017年1月-3月，與外環境H7N9禽流感病毒流行時間相一致。本研究提取10份H7N9病例咽拭子標本核酸，對血凝素基因(HA)、神經氨酸酶基因(NA)和烷胺類藥物耐藥基因(M2)基因進行全長測序，旨在掌握禽流感重要蛋白位點和耐藥位點遺傳變異情況，為掌握廣州地區人感染H7N9禽流感病毒分子流行特點和指導臨床用藥提供參考依據。

本研究結果分析顯示，與肇慶地區人感染H7N9病毒相比[12]，廣州地區H7N9禽流感病毒基因同源性差異較大，同時大部分毒株基因與廣東毒株同源性最高，部分毒株基因與河南、內蒙古等地毒株同源性最高，呈現基因變異多樣性。HA蛋白即流感病毒的血凝素，也是禽流感病毒的重要表面抗原之一[13]，HA 蛋白裂解位點附近多堿性氨基酸序列特征可被存在于人呼吸道細胞的某些特定蛋白酶切割裂解，有利于病毒在人呼吸道的復制[14]，一般認為HA裂解位點附近具有4個以上連續的堿性氨基酸插入是高致病性禽流感病毒重要的分子標志[15]，早在2016年肇慶地區研究的7份人源H7N9禽流感病毒[12]，裂解位點均表現為2個堿性氨基酸插入，即為低致病禽流感病毒分子特點，該結果與浙江、安徽的序列一致[16-17]，2017年淮南分離的病毒只有1個堿性氨基酸存在[18]。直到2017年首次在病例中分離到高致病性H7N9禽流感病毒變異株。本研究也同樣發現，在2017年廣州病例中監測到5株病毒的裂解位點出現4個連續的堿性氨基酸插入，提示說明廣東地區自2017年開始高致病性H7N9禽流感變異株廣泛存在。

不同宿主來源的流感病毒對唾液酸分子的識別具有特異性，人流感病毒主要優先識別唾液酸α-2, 6半乳糖(SAα-2, 6Gal)，禽的流感病毒識別SAα-2, 3Gal[19]。進一步研究發現HA蛋白第226位、228位氨基酸起著關鍵的作用。本研究中5株病毒出現了Q226L的突變，提示對人呼吸道上皮細胞SAα-2, 6Gal受體結合能力增加，同時也有研究表明廣東省內流行的人感染H7N9禽流感病毒普遍獲得與人呼吸道上皮細胞受體結合的能力[20]。糖基化位點主要位于禽流感病毒的HA和NA蛋白，其位置和數目的變化會影響功能蛋白進而影響病毒的毒力和致病性[21-22]。HA蛋白糖基化位點主要在第30、46、249、421、493位共5個位點，NA蛋白糖基化位點主要在第42、52、63、66、87、147、202位共7個位點，以往研究結果中[12,18]，上述位點均相對保守，未出現缺失或增加。但本研究中，HA蛋白136位增加了1個糖基化位點，NA蛋白63位糖基化位點有缺失，而增加了341、454位糖基化位點。毒力相關位點上，包括HA蛋白D225G、M1蛋白N30D 和T215A均發生突變，同時NA蛋白均出現頸部氨基酸缺失，提示廣州人感染H7N9禽流感病毒毒力增強。

目前抗流感藥物分為兩類，一類是M2蛋白離子通道阻斷劑-烷胺類藥物，大量研究顯示H7N9禽流感病毒均出現S31N突變耐藥[23]，因此該類藥物臨床已少有使用。另一類為神經氨酸酶抑制劑，為當前人感染禽流感病毒以及暴露后預防的首選藥物，以往研究均未發現耐藥突變株的出現[12,20,23]，本研究在2017年H7N9禽流感病例中發現2株高致病性變異株分別出現E120K、R294K耐藥突變，而R294K突變可導致病毒對達菲的耐藥。

當前我國流行的H7N9禽流感病毒均屬于歐亞譜系，自2013年H7N9在我國廣泛流行以來不斷進化，主要分為以長三角為中心的華東分支和以珠三角為中心的華南分支。遺傳進化分析發現，2017年廣州人感染H7N9禽流感病毒HA基因和NA基因在華南和華東分支均有分布，而高致病性變異株主要分布在華南分支，進一步推斷華南地區為高致病性H7N9變異株的起源地。M1基因進化特點相對復雜，分別與華南地區H9N2、H7N9病毒，以及北方地區的H7N9病毒重組，同一基因不同毒株進化分支可能不同，表現出遺傳進化的多樣性，同一毒株不同基因進化分支也可能不同，表現出遺傳進化的復雜性。林慕蕾等[20]在研究中指出，H7N9病毒在廣東的不同時間點具有遺傳多樣性，而廣州早在2014年首次出現本地病例以來，H7N9禽流感病毒又是經歷了怎樣的進化，需要進一步回顧性研究。

疫情早期H7N9禽流感病毒的M1基因來源于華東地區的H9N2，隨著H7N9禽流感病毒傳入華南地區，內部基因與華南地區禽流感病毒不斷發生重組[24]，本研究結果也發現，H7N9病毒內部基因出現本地化基礎上，仍然不斷重組進化，特別是本研究中，發現高致病性耐藥株的M1基因與北方地區H7N9病毒重組的現象，提示高致病性耐藥株有向華南以外地區傳播的風險。此外，大量研究表明活禽市場是病毒發生重組的重要場所，而外環境H9N2病毒長期廣泛存在，可能會加速H7N9禽流感病毒重組進化，因此應當加強廣州地區H7N9禽流感病毒持續監測。

利益沖突：無