單核細胞增生李斯特菌的耐藥特征及機制

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單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種重要的食源性人獸共患病原菌，其對食品安全及人類健康的影響已經引起很多國家的高度重視。Lm引起的人和動物的李斯特菌病具有低發病率、高致死率的特點。據統計，人李斯特菌病發病率約每百萬人0.1～11.3例，死亡率為20%～30%[1]。Lm具有第一代喹諾酮類藥物、磷霉素和第三代頭孢菌素的天然耐藥性，對臨床上常用于革蘭氏陽性菌的各種抗生素均敏感[2]。但1988年[3]首例李斯特菌四環素耐受株出現以來，不斷有研究報道從各類食品及臨床病例中分離到一種甚至多種抗生素耐受的菌株[4]。弄清Lm耐藥性的產生機制，從而控制多重耐藥菌的產生和傳播，已經成為我們面臨的重要工作任務之一。

1 單核細胞增生李斯特菌耐藥特征

細菌耐藥問題一直是國內外的關注焦點和研究熱點，WHO已將其列為本世紀最大的公共安全問題之一。長期以來世界各國均對不同來源的Lm的耐藥性進行了密切監測，表1展示了不同地區食品及臨床樣品中分離的Lm的耐藥情況。

在國內，2012年閆韶飛[5]等對分離自我國23個地區10類食品的635株Lm進行藥敏實驗，結果顯示平均耐藥率為10.39%，多重耐藥率為1.1%，其中生豬肉(26.67%)和生牛肉(25%)中分離的菌株耐藥率最高。2015年Shi W[6]等報道我國即食食品來源的Lm耐藥率為67.5%，其中21.25%的菌株對兩種及以上的抗生素耐受。國外Lm食品分離株耐藥現狀同樣嚴峻。Lm污染的生肉、即食食品、水產品、冰淇淋和蔬菜進入食物鏈是造成歐洲、北美洲、亞洲和非洲等地區爆發的李斯特菌病的主要原因。在西班牙，Gómez[7]等報道2009-2012年間分離自肉制品及環境樣品的206株Lm耐藥率為34.5%，多重耐藥率為2.9%。Chen[8]等報道美國水產及環境樣品中分離的Lm對頭孢噻肟、克林霉素的耐藥率分別為71%和69%。在馬來西亞，Lm即食食品分離株耐藥率為57.6%，多重耐藥率高達47.4%，對青霉素(53%)、四環素(15.6%)、萬古霉素(9.4%)和紅霉素(6.3%)的耐藥尤其顯著[9]。在埃塞俄比亞，Garedew[10]等報道2012-2013年分離自即食食品的Lm多重耐藥率為16.7%。綜合國內外研究報道，食品源Lm呈現耐藥率不斷升高和耐藥譜逐漸變寬的趨勢，無疑給李斯特菌病的臨床用藥造成一定困難。從菌株來源看，國內外動物性食品如禽畜肉類、即食食品中分離的Lm具有較高的耐藥水平。據美國疾病防控中心統計，2013年美國市場上出售的抗生素中73%由獸醫購買[11]。畜牧業中抗生素的大量使用導致了禽畜肉制品中抗生素的殘留以及從中分離的菌株存在較高的耐藥性。有研究表明，細菌耐藥性與抗生素的消耗量有關[12]。一個典型的例子即四環素。國內食品源Lm對四環素耐藥最為嚴重[5,13-15]。作為一類廣譜抗生素，四環素常作為預防和治療禽畜疾病或促進禽畜生長的飼料添加劑被大量應用于養殖業[16]，抗生素對細菌的選擇壓力導致了Lm四環素耐藥水平的提高。由此可見，細菌的耐藥性與抗生素的使用密切相關，對于使用時間越久、使用范圍越廣、使用頻率越高的抗生素，耐藥現象越普遍[17]。

目前，臨床上用于治療李斯特菌病的藥物主要為β-內酰胺類抗生素(氨芐西林、青霉素)，可單獨使用或與慶大霉素聯合使用。常使用的備選治療方案為甲氧芐啶和磺胺類藥物[18]。Lm臨床分離株的耐藥監測對于科學合理用藥至關重要，臨床藥物的誤用或過度使用是細菌產生耐藥性的一個重要原因。孫照琨[19]等對1963-2013年間國內臨床Lm耐藥率進行統計，復方新諾明、慶大霉素、丁胺卡那霉素、青霉素、環丙沙星和氨芐西林總體耐藥率較高，分別為40.9%、23.0%、21.7%、18.9%、14.3%和11.1%。國外臨床分離株耐藥性同樣不容樂觀。Hansen J M[20]等報道1958-2001年間丹麥Lm臨床分離株對慶大霉素(1.9%)、復方新諾明(6%)和環丙沙星(0.9%)耐受。在葡萄牙，Magalhaes R[21]等對Lm臨床分離株進行耐藥檢測，結果顯示環丙沙星、利福平、呋喃妥因和鏈霉素的耐藥率分別為24.1%，13.8%，41.4%和58.1%，其中有29株(14.3%)對兩種及以上抗生素耐藥。Morvan[22]等報道1926-2007年間法國臨床分離的4 816株Lm耐藥率為1.27%，主要耐受四環素和喹諾酮類抗生素。1970-2008年間巴西Lm臨床分離株的藥敏實驗結果顯示利福平、復方新諾明耐藥率分別為1.5%和2.9%[23]。Borcan[24]等對2009-2013年間羅馬尼亞Lm臨床分離株進行藥敏試驗，結果顯示氨芐西林、青霉素耐藥率均為7.7%。綜上所述，盡管Lm臨床分離株的耐藥率和耐藥種類在地區上存在差異，但許多國家均出現對氨芐西林、青霉素等臨床一線藥物耐受甚至多重耐藥的報道，這無疑會導致臨床經驗性治療難以奏效，給重癥感染患者的治療帶來巨大困難。整體來看，臨床和食品來源Lm均對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類等抗生素表現出耐藥性，提示耐藥菌株存在經食品加工、銷售環節傳染給消費者的潛在風險，且部分人群因長期使用抗生素又會進一步導致細菌耐藥性的增強。

表1 不同地區食品及臨床樣品中分離的Lm耐藥株Tab.1 Antibiotic-resistant Lm isolated from food and clinical in different regions

2 單核細胞增生李斯特菌耐藥機制

在抗生素的選擇性壓力下，耐藥菌株不斷出現，特別是多重耐藥性菌株，而耐藥菌株通過動物產品產業鏈從農場到餐桌，最終造成嚴重的公共衛生問題。因此，弄清Lm的耐藥機制對于李斯特菌病的預防和控制將具有重要意義。Lm的耐藥機制十分復雜，包括可移動元件介導的耐藥基因轉移、藥物作用靶點的改變、藥物的外排作用、鈍化酶或滅活酶的產生、生物被膜等多種機制。

2.1可移動元件介導的耐藥基因轉移 不耐藥的Lm可以通過獲得攜帶抗生素耐藥基因的可移動元件產生耐藥性。轉座子、整合子和質粒等可移動元件在腸球菌和鏈球菌中普遍存在，并能在腸球菌、鏈球菌和李斯特菌內部及各菌種之間傳遞[25]。與四環素耐藥密切相關的Tn916是一種廣宿主接合性轉座子，與Tn1545一起被稱為Tn916/Tn1545家族。Tn916通常攜帶有tet(M)基因。tet(M)基因能通過接合作用從無害李斯特菌轉移到Lm、綿羊李斯特菌和糞腸球菌，也可從糞腸球菌轉移到Lm[26]。Tn1545在體內外都能通過接合作用從糞腸球菌轉移到Lm[27]。質粒pIP501宿主范圍廣泛，可介導細菌對氯霉素類、大環內酯類、林可酰胺類和鏈霉素類抗生素的耐藥性。pIP501可通過接合作用進入Lm胞內并進行復制，并能在李斯特菌屬和鏈球菌之間轉移[28]。

2.2藥物作用靶點的改變Lm能通過改變或修飾抗菌藥物結合靶位或使得藥物作用的靶基因發生突變，使得靶基因表達產物的空間構型與理化性質發生變化，從而導致細菌對抗生素變得不敏感。Lm中存在的四環素耐藥基因tet(M)、tet(S)能通過編碼的核糖體保護蛋白(RPPS)與核糖體結合，從而阻止四環素對細菌蛋白合成的抑制作用，從而產生耐藥性。Lm細胞膜上存在至少5種青霉素結合蛋白(PBP)，β-內酰胺類抗生素通過與PBPs結合，抑制了細菌細胞壁的合成從而引起細胞死亡。而當細胞膜上PBPs數量減少或結構改變，抗生素與其結合力便顯著降低，就會產生耐藥[29]。部分Lm耐藥菌株具有ermB、ermC基因，能夠編碼紅霉素核糖體甲基化酶，降低核糖體與抗生素的結合力，介導Lm對紅霉素的高水平耐藥[30]。

2.3藥物的外排作用 藥物外排泵是位于細菌細胞膜上的一類功能性膜轉運蛋白，當細胞內藥物濃度達到某一臨界值時，細菌能依靠主動外排泵出機制來降低細菌體內藥物的濃度，從而使菌體產生耐藥表型。對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等細菌，外排泵導致的耐藥是其耐藥的主要原因。Lm中存在MdrL和Lde兩種外排泵，分別由mdrL和lde基因編碼[31]。大環內酯類抗生素、頭孢噻肟以及重金屬和溴化乙錠均由MdrL泵出；Lde屬于細菌外排系統中常見的主要易化子超家族(Major facilitator superfamily, MFS)，是一種自足型多藥外排轉運蛋白，與Lm的喹諾酮耐藥性密切相關，可利用質子偶聯交換產生的質子驅動力外排多種化學結構不同的底物，從而降低細胞內相應物質的濃度。

2.4鈍化酶或滅活酶的產生 產生滅活酶是引起細菌耐藥性的機制之一。細菌產生的滅活酶主要有β-內酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶等，這些酶可破壞抗生素或使之失去抗菌作用，使藥物作用于菌體前就被破壞或失活。細菌由質粒介導或染色體突變而產生β-內酰胺酶，通過水解和非水解方式(酶與抗生素結合形成穩定的復合物)破壞β-內酰胺環，使抗生素失活。氨基糖苷類修飾酶是細菌對氨基糖苷類抗生素產生耐藥的主要機制，其主要催化氨基糖苷類藥物氨基或羥基的共價修飾，使得氨基糖苷類藥物與核糖體的結合減少，促進藥物攝取的EDP-II也被阻斷而產生耐藥性[32]。有報道Lm通過在腸球菌-鏈球菌中廣泛存在的aad6基因，產生6-N-鏈霉素腺苷酰基轉移酶，從而產生對鏈霉素的耐受[33]。

2.5細菌生物被膜的形成 生物被膜通過多種機制相互協調參與耐藥形成，如通過屏障作用減少抗菌藥物的滲透、形成類似芽孢細胞的狀態使細菌對抗菌藥物不敏感、細菌傳感效應的調節等。有報道細菌在生物被膜狀態下更容易吸收外源基因進入菌體細胞內，從而利于耐藥基因的獲得[34]。細菌形成生物被膜后，能抵抗百倍以上正常劑量的藥物，呈高度耐藥[35]。影響Lm生物被膜形成的關鍵因子有鞭毛糖蛋白、胞外DNA、胞外多糖、胞外結合蛋白和群體感應系統等[36]。鞭毛調節因子DegU通過調控鞭毛糖蛋白基因的轉錄直接影響生物被膜的形成。胞外DNA參與Lm粘附和生物被膜早期的形成，并與胞外多糖、胞外結合蛋白共同組成胞外基質。Lm的Agr群體感應系統可以直接正調控生物膜，也可通過調控毒力因子、耐藥因子間接調控生物膜，是一種整體水平的調控網絡體系。

3 展 望

李斯特菌病作為一種由Lm感染引起的食源性疾病，不僅影響食品安全甚至危及人類生命。近年來國內外食品及臨床分離的Lm耐藥譜逐漸變寬，中國、丹麥、巴西、羅馬尼亞等國均出現對氨芐西林、青霉素等臨床一線藥物耐受甚至多重耐藥菌株的報道。耐藥菌株通過動物產品產業鏈從農場到餐桌進行傳播，對公眾健康帶來威脅，最終造成嚴重的公共衛生問題。應加強對各種來源的Lm的分子流行病學研究及耐藥性監測，臨床上應謹慎、合理使用抗生素，減緩細菌耐藥性的產生。弄清Lm的耐藥機制對于李斯特菌病的預防和控制同樣具有重要意義。

利益沖突：無