2016年福建省單核細胞增生李斯特菌臨床病例及食品來源菌株的分子特征分析

，，， ，

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種重要的食源性人獸共患病原菌，老人、兒童、孕婦和免疫力低下者容易感染，可引起胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、孕婦流產等癥狀。孕婦感染的危險度比健康成年人高出20倍。2001年起被美國列為法定上報的疾病[1]。2011年美國一起因哈密瓜引起的李斯特菌病暴發，涉及美國28個州，導致147人患病，33人死亡，1例流產[2]，1998年，我國香港和臺灣發生李斯特菌暴發事件，甜筒、冰激凌和雪糕等被污染，造成許多兒童發病[3]。馮延芳等收集文獻資料統計：2000-2009年我國16個省共報告92例李斯特菌病例，病例臨床特征、報告死亡率等與歐美相似[4]。我國食源性疾病監測顯示，國內人感染單核細胞增生李斯特菌散發報告數逐年上升，2016年全國報告82例病例，主要以孕婦和新生兒為主。福建省單核細胞增生李斯特菌感染病例未見文獻報道。為了解福建省單核細胞增生李斯特菌感染的流行病學及病例和食品來源株的分子特征，提高溯源能力，在福建省建立3家哨點醫院，采用血清分型和PFGE分型方法對分離菌株進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 病例調查方法

1.1.1病例定義 具有單核細胞增生李斯特菌感染的臨床表現，主要為腦膜炎、敗血癥、先兆流產、早產、死產等。從無菌的標本(血液、腦脊液)或妊娠產物(羊水或胎盤等)中分離到單核細胞增生李斯特菌。

1.1.2監測對象 孕婦、嬰幼兒、老人等免疫力低下者。

1.1.3病例信息采集 由臨床醫生對符合監測病例定義的病人進行信息采集，接到報告的疾病預防控制中心對陽性病例開展流行病學調查。

1.2 菌株來源

1.2.1病例菌株 醫院實驗室采集生物標本按照《2016年食源性疾病監測工作手冊》[5]進行單核細胞增生李斯特菌檢驗。3株單核細胞增生李斯特菌病例株來自2016年泉州、福州和廈門市婦幼保健院分離(其中新生兒血液標本2份、胎盤母面標本1份)。

1.2.2食品菌株 8株單核細胞增生李斯特菌來自2016年福建省食品微生物監測分離株(7株分離自市售即食食品壽司，1株分離自福建某冷凍飲品廠的環境樣本)。

1.2.3單核細胞增生李斯特菌 標準菌株(CMCC 54004和CMCC54007)來自中國藥品生物制品檢定所；PFGE參考菌株沙門氏菌H9812由中國疾病預防控制中心傳染病所提供。

1.3試劑 APIListeria生化鑒定試劑條(法國bioM erieux)，單核細胞增生李斯特菌顯色培養基(法國科瑪嘉)，血平板(北京陸橋公司)。Tap DNA聚合酶(BBI)，瓊脂糖(TakaRa)，5×TBE、1 mol/LTris-HCL緩沖液和0.5 mol/L EDTA(Solarbio)，Tris base、EDTA 和boric Acid (BBI)，N-Lauroyl-Sarcosine Sodium salt(Sarcosy1)(Sigma), 溶菌酶(Sigma)，蛋白酶K粉末(Merck)，XbaI和AscI酶(NEB)， SeaKem Gold Agarose(Gene)。多重PCR引物由上海生工公司合成。單核細胞增生李斯特菌型別免疫血清購自日本生研公司。以上培養基和試劑均在有效期內使用。

1.4儀器 核酸擴增儀(德國Biometra)，CHEF Mapper XA及凝膠成像系統(美國伯樂)，超純水儀(美國miniPALL)，臺式離心機(德國Eppendorf)，比濁儀(法國生物梅里埃)，水浴搖床(英國Grant)。

1.5 菌株鑒定與分型方法

1.5.1菌株復核 分離株均經GB 4789.30-2010方法驗證。

1.5.2血清學分型 多重PCR測定血清型別方法采用的5對引物序列參照文獻[6]。免疫血清分型方法按照說明書，用玻片凝集法確定O抗原，用試管法確定H抗原。

1.5.3PFGE分子分型與聚類分析 按照單核細胞增生李斯特菌PFGE操作程序[5]進行，選用AscI酶進行plug中DNA的酶切，PFGE圖譜用BioNumerics 7.6軟件進行聚類分析。

2 結 果

2.1病例信息 2016年3例單核細胞增生李斯特菌感染病例中2例為早產的新生兒，1例孕婦，調查結果見表1。第1例病例抗生素治療2 d后未痊愈，家長放棄治療帶回。第2例病例為孕婦咳嗽、乏力、發燒，柴胡退熱、靜滴青霉素抗感染治療，入院查體胎心未聞及，本次妊娠為人工受精。第3例病例為新生兒敗血癥，抗生素治療后存活，其母親4周內食用過生食蔬菜、現制現售飲料和西式沙拉。

2.2菌株復核結果 11株分離株經鑒定均為單核細胞增生李斯特菌，API Listeria 生化鑒定編碼均為6710。

2.3血清型別 11株單核細胞增生李斯特菌株多重PCR分型結果見圖1，與傳統免疫血清方法結果一致，分屬3個血清型：1/2a、1/2b和4b。3株病例株中2株1/2a 型、1株4b型；8株食品株中4株1/2a來自漳州和福州的壽司、2株4b來自福州和漳州的壽司，1株1/2b來自福州的壽司，1株1/2a來自冷凍飲品廠地板分離株。

表1 2016年3例單核細胞增生李斯特菌陽性病例的臨床資料及流調信息Tab.1 Clinical and epidemiological information of three confirmed Listeria monocytogenes cases in 2016

M：100bp DNA Ladder；1-12：CMCC54004(1/2a型)、CMCC54007(4b型)、DZ-47、JDZ-02、JDZ-01、JDZ-03、JDZ-04、DZ-A16043、 DZ-A16114、DZ-E16087、DZ-E16094、DZ-E16023；13-14：空白對照組

2.4PFGE型別 11株單核細胞增生李斯特菌PFGE聚類分析結果見圖2，分為10種帶型，其中3株病例分離株的PFGE相似度小于80%，無同源性。與同年份福建省即食食品壽司中分離株的相似度不高，亦無同源性。不同血清型4b與1/2a的PFGE帶型相似度較差，為57.8%。

圖2 11株單核細胞增生李斯特菌PFGE聚類分析Fig.2 PFGE profile of 11 L. monocytogenes

3 討 論

2016年福建省監測到的3例單核細胞增生李斯特菌病例均為免疫力低下人群(孕婦和新生兒)，發生月份集中在6～8月，符合單核細胞增生李斯特菌“夏秋季呈季節性增長”的特點[3]。已有研究表明，本病病死率可高達30%～35%[3]。連凱等[7]統計我國2002-2012年報告人李斯特菌感染病例80例，總病死率為19%，其中病死率最高的人群為免疫缺陷患者(40%)，其次為新生兒患者(31%)。目前，臨床上應對李斯特菌病主要采用抗生素治療，藥物首選氨芐西林[3]。早發現、及時檢測、正確應對，必要時給予合理、足量的抗生素治療可以有效防控[1]。此外，加強對高風險人群的宣教活動，可以顯著降低單核細胞增生李斯特菌病的發生[8]。

本次監測的單核細胞增生李斯特菌病例菌株血清型為1/2 a和4b，即食食品分離株為1/2a、1/2b和4b，均為國內外常見的血清型。王麗麗等[9]研究北京市2013-2015年32株人源性單核細胞增生李斯特菌血清型，以1/2b和1/2a型為主，分別占53.1%和37.5%。國外報道[10]，單核細胞增生李斯特菌具有流行病學重要性的血清型有4b(占37%～64%的病例)、1/2b(占10%～35%的病例)和1/2a(占15%～25%的病例)，血清型4b引起的疾病在孕婦病例中明顯較多。福建省凍畜禽肉類等市售食品中單核細胞增生李斯特菌的污染率為38.46%～30.30%，30株食品分離株血清型主要以1/2a 為主，未見4b血清型[11]。2016年即食食品壽司監測分離的7株單核細胞增生李斯特菌中發現2株4b血清型的菌株均來自海鮮壽司(含三文魚等)，是否與進口海產有關有待進一步調查研究。應加強對即食食品中單核細胞增生李斯特菌的監測并引起重點人群的高度關注。

本次PFGE聚類分析可以看出，病例菌株的PFGE分子型別與同年度省內食品分離株之間無同源性，說明2016年監測病例均為單核細胞增生李斯特菌散發病例，且病例分離株與監測到的即食食品分離株之間無相關性。由于李斯特菌病潛伏期長，臨床癥狀容易被忽略，流行病學調查中對可疑致病食品的回顧難度大，病原菌較難追蹤溯源。應借鑒國外監測經驗，納入法定上報疾病，建立病例分離株的型別數據分析和比對，及時對聚集性病例進行流行病學調查和快速溯源，摸清流行規律，采取針對性的防治措施，才能減少單核細胞增生李斯特菌病的發生。

利益沖突：無