2009-2017年江蘇省手足口病病原譜及柯薩奇A16型的分子流行病學研究

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手足口病(Hand, foot and mouth disease，HFMD)是一種由多種腸道病毒引起的急性傳染病，多發于5歲以下兒童[1-3]。大多數患者以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征，病程5～7 d，一般預后良好，但少數重癥患者可迅速出現中樞神經系統、呼吸系統及心血管系統等全身并發癥，如腦炎、腦膜炎、急性弛緩性麻痹、肺水腫和心肌炎等，該類患者病情進展快，易發生死亡。手足口病傳染性強，傳播機制容易實現，托幼機構等集體單位由于易感者集中，容易發生聚集性和暴發疫情[4-5]，處置不當可在短時間內造成較大規模的暴發流行。自2009年至2017年全國累計報告HFMD 17 694 904例，重癥病例數149 227例，死亡3 506人，發病數居法定傳染病首位。HFMD在我國的流行造成了嚴重的經濟和社會負擔，給公共衛生機構帶來巨大的挑戰。

在我國，手足口病基本上是由腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CVA16)引起為主[6-8]，HFMD重癥和死亡病例的病原構成以EV7l占絕對優勢。CVA16引起的手足口病癥狀較輕，較少有并發癥發生。但近年來，幾起比較嚴重的手足口疫情均是由EV71和CVA16的共同循環導致[9-10]，EV71和CVA16混合感染亦有報道[11-12]，而疫情監控和疫苗研發則主要集中于EV71。此外，我國自主研制的EV71滅活疫苗已于2015年12月獲批上市， EV71滅活疫苗的廣泛接種可能會使流行毒株從EV71向CVA16或其他腸道病毒轉移。本研究對2009-2017年江蘇省手足口病病原譜進行調查，并對CVA16 VP1 基因進行進化分析，以明確江蘇省手足口病的病原譜流行情況及CVA16的分子流行病學特征。通過對疫苗使用前后江蘇省CVA16的流行趨勢和病原學變遷進行連續監測，為本省HFMD的有效防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1資料和標本來源 手足口病病例資料來源于“中國疾病預防控制信息系統”，收集2009-2017年江蘇省手足口病報告病例個案、人口學信息(性別和出生日期)、病原學結果(EV71、CVA16、其他腸道病毒)、病例類型(臨床診斷病例、實驗室診斷病例、重癥病例)等信息，其中CAV16病例為發病日期在2009-2017年間實驗室結果為CVA16核酸檢測陽性的HMFD病例。標本來源于2009-2017年江蘇省13個地級市按照江蘇省手足口病監測工作方案要求上送至江蘇省疾病預防控制中心的CVA16核酸檢測陽性標本(咽拭子或肛拭子)。

1.1.2病例定義 臨床診斷病例是發熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無發熱。臨床診斷病例符合下列條件之一，即為實驗室診斷病例：特異性RNA檢測陽性、病毒分離陽性或急性期與恢復期血清中和抗體有4倍或4倍以上的升高。重癥病例是出現神經系統受累、呼吸及循環功能障礙等表現，實驗室檢查可有外周血白細胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動圖檢查異常[13]。

1.1.3儀器與試劑 全自動核酸提取儀MagNA Pure LC及配套試劑購自Roche公司，QIAxcel毛細管電泳儀及配套試劑購自QIAGEN公司，OneStep RT-PCR Kit購自QIAGEN公司，胎牛血清、青霉素和Opti-MEM培養液購自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1病毒分離 將核酸檢測結果為CVA16陽性的標本接種于人橫紋肌肉瘤(RD)細胞，采用含2%胎牛血清、100 U/mL青霉素的Opti-MEM培養液于37 ℃、5%CO2條件下培養5～7 d，每日觀察細胞病變(cytopathic effect，CPE)，盲傳兩代，若出現細胞病變，收獲培養上清液，并儲存于-80 ℃。

1.2.2核酸提取 按照Roche公司MagNA Pure LC全自動核酸提取儀和MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit的操作說明，提取上述毒株核酸并放置于-80 ℃保存。

1.2.3CVA16 VP1基因擴增和測序 采用One-step RT-PCR Kit對CVA16分離株VPl基因進行擴增，并設置陰性對照。擴增引物序列分別為： CVA16-VP1-F: 5′-AGGTACTACACCCAGTGGTCAG-3′(2 030-2 052 nt), 和 CVA-VP1-R: 5′-GCAAGGTGCCGATTCACTACCCT-3′(3 400～3 423 nt)。PCR反應條件為：50 ℃逆轉錄30 min, 95 ℃變性15 min, 95 ℃，30 s, 52 ℃，45 s, 72 ℃，90 s,35個循環，72 ℃延伸10 min。上述擴增產物采用QIAxcel毛細管電泳儀檢測驗證后送上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.2.4生物信息學分析 采用DNAStar軟件對測序獲得的CVA16 VP1序列進行核苷酸和氨基酸序列分析及同源性比較，構建系統發生樹采用Mega 5.0軟件的最大似然法(Maximum Likelihood)。

1.2.5統計學分析 采用Excel 2007軟件進行數據整理，利用SPSS17.0軟件進行數據分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1發病概況 2009-2017年江蘇省共報告手足口臨床診斷病例1 013 771例，報告年均發病率為142.86/10萬(1 013 771/ 709 615 095)，發病率最高為2014年的210.52 /10萬，最低為2009年的109.35/10萬；其中,重癥9 379例，年均重癥百分比為0.93%(9 379/ 1 013 771)；重癥百分比最高為2011年的1.78%，最低為2009年和2016年的0.42%，年重癥百分比呈下降趨勢。報告病例中男性構成比59.27%～62.24%。自手足口病成為法定報告傳染病以來，病例報告和監測不斷完善和改進，江蘇省手足口病報告趨于穩定，2012年后出現偶數年份較奇數年份高發的特點，見表1。

2.2病原學檢測 2009-2017年江蘇省共檢測出手足口病腸道病毒(EV)陽性病例37 389例。除2009年，其他年份每年檢出的腸道病毒陽性病例均在3 600份以上，其中，EV71占39.85% (14 898/39 389)， CVA16占30.13%(11 265/37 389)，其他腸道病毒占28.88%(10 798/37 389)。2009-2017年，EV71在腸道病毒陽性病例中的年度構成比分別為45.14%、49.55%、50.66%、40.72%、35.96%、39.72%、15.03%、29.51%和47.26%，而CVA16在腸道病毒陽性病例中的年度構成比分別為40.34%、31.26%、29.15%、41.05%、11.97%、34.82%、29.46%、30.79%和21.34%，因此EV71和CVA16為占據主導地位的兩種血清型，如圖1所示。重癥病例中，主要以EV71血清型為主，在2009-2017年的重癥病例中，EV71的年度構成比分別為85.49%、80.45%、80.06%、79.80%、67.74%、83.99%、94.72%、67.70%、86.18%，而CVA16的年度構成比分別僅為4.15%、3.76%、8.16%、12.23%、1.34%、5.28%、0.77%、7.80%、3.92%，如圖2所示。

圖1 2009-2017年江蘇省手足口病病原構成及腸道病毒陽性病例數Fig.1 Enterovirus positive HFMD cases and distribution of enterovirus strains in Jiangsu province, 2009-2017

圖2 2009-2017年江蘇省手足口病重癥病原構成及重癥病例數Fig.2 Enterovirus-associated severe HFMD cases and distribution of severe enterovirus strains in Jiangsu province, 2009-2017

2.3 CVA16流行病學特征

2.3.1人群分布 如圖3所示，2009-2017年江蘇省CVA16高發年齡段主要集中在6月齡～5歲，尤其是12-23月齡，小于6月齡，大于5歲和成年人發病率低。CVA16感染病例中男性構成比介于55.97%～66.97%，其病例數年齡和性別分布與總體HFMD人群分布相近。

圖3 2009-2017年江蘇省CVA16發病年齡分布Fig.3 Age distribution of CVA16 cases in Jiangsu province, 2009-2017

2.3.2時間分布 如圖4所示，CVA16發病時間主要呈一主峰一次峰的雙峰流行，2009-2011年主峰發生在3-6月份，2012-2017年主峰發生在3-7月份；2010、2016和2017年無明顯次峰，其余年份次峰發生在9-11月，次峰遠低于主峰。

圖4 2009-2017年江蘇省CVA16發病時間分布Fig.4 Distribution of CVA16 infection in Jiangsu province, 2009-2017

2.4VP1基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析 對2009-2017年江蘇省104株CVA16型輕癥病例，16株CVA16重癥病例分離株進行VP1基因核苷酸序列測定和分析。CVA16毒株VP1基因核苷酸序列長度為891 bp, 編碼297個氨基酸。120株CVA16毒株VP1序列提交到NCBI數據庫，104株CVA16輕癥GenBank登錄號為MH516915-MH517015, 16株CVA16重癥GenBank登錄號為：MH491122-MH491129, MH491131-MH491134和MA491136-491139。利用DNAStarMegAlign軟件進行VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對分析。120株CVA16毒株的核苷酸與氨基酸序列同源性分別為 87.5%～100%、 97%～100%。120株毒株的VP1基因與A基因型、B基因型各亞型B1a和B1b以及B2基因型VP1區核苷酸和氨基酸同源性比較結果見表2。

表2 江蘇省CVA16分離株與CVA16不同基因性及亞型代表株VP1核苷酸與氨基酸同源性比較Tab.2 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA16 strains from Jiangsu province and reference genotype (subgenotype) CVA16 strains based on VP1 genes

2.5江蘇省CVA16分離株VP1區編碼蛋白變異位點分析 將VP1完整編碼區翻譯成氨基酸序列進行分析，發現2009-2017年江蘇省的120株CVA16氨基酸序列的第23位點是氨基酸變異的頻繁區域，65株CVA16分離株發生了L→M的突變,其次是第218位點，7株CVA16分離株發生了N→G的突變。上述突變在輕癥和重癥病例中呈現無規律散在分布。

2.6CVA16分離株VP1基因進化分析 選取從GenBank下載的45條國內其他省(市)和其他國家或地區有代表型的CVA16 VP1全長序列，分別來自美國、馬來西亞、美國、越南、日本、泰國和中國臺灣等國家或地區以及我國大陸的山東、河南、湖南、廣東、浙江等省(市)[14-16]，與2009-2017年江蘇省的120條CVA16 VP1序列進行遺傳進化分析，并構建系統進化樹。結果表明，2009-2017年120株CVA16江蘇分離株與B1a和B1b亞型代表株分別處于同一分支上(見圖5)，與原型株G-10及國外地區分離株的遺傳距離較遠，與國內地區(如河南、山東、浙江等省份)分離株的遺傳距離近，親緣關系近。120株CVA16江蘇分離株相互之間的遺傳距離較近，親緣關系近。同時，進化樹顯示，江蘇省分離株在年度和各個地區分布上交錯分布，無明顯聚集性，輕癥和重癥的毒株未在進化樹上呈現規律分布。

A:CVA16分離株VP1區進化樹分析； B:部分CVA16分離株VP1區進化樹分析 ▲：輕癥 CVA16 分離株；●: 重癥 CVA16 分離株

3 討 論

本研究系統描述2009-2017年連續9年間江蘇省HFMD的發病情況和CVA16的病原學監測結果，為HFMD防控策略的制定及EV71疫苗上市后CVA16的流行趨勢和病原學變遷提供了詳細的流行病學數據。

江蘇省是我國手足口病的流行區，2009-2012年江蘇省手足口病報告病例持續上升，2013年有所回落，之后呈現偶數年高發奇數年低發的流行特征，年均發病率為142.86/10萬，年發病率總體呈上升趨勢。而重癥病例數自2015年后明顯下降，這可能與2016年EV71疫苗上市有關。

病原學監測數據顯示，江蘇省2009-2017年手足口病主要由EV71和CVA16引起，同時每年均伴隨其他腸道病毒的感染。EV71感染率呈現下降趨勢，但2017年有所回升；CVA16總體感染率呈下降趨勢，其他腸道病毒感染率逐步上升。重癥病例中，年重癥百分比成下降趨勢，2009-2016年間每兩年出現一次重癥高峰，但2017年的高峰并不明顯，這可能與人們對手足口病的重視以及EV71疫苗上市有關。病原方面重癥病例仍然以EV71為主要病原， CVA16及其他腸道病毒引起的重癥病例較少。而在2012年，CVA16引起的重癥病例數明顯增加，占12.23%，這可能與2012年EV71流行強度較小，而CVA16流行強度較高有關。之后CVA16引起的重癥病例數有所回落，2015年最低，為0.77%。2016年CVA16引起的重癥病例數再次增加。

對2009-2017年江蘇省CVA16感染病例進行流行病學特點和病原學特點進行描述分析，其病例數年齡分布與總體HFMD年齡分布相近。CVA16易感人群是6個月～5歲嬰幼兒，尤其1～4歲組CVA16感染最高，與其他研究報道相似[17-18]，這可能與低年齡組免疫水平低下有關[19]。CVA16感染人群男性多于女性，這可能是男孩喜愛活動，更多暴露在病毒環境中有關。

CVA16各年發病呈現兩個季節性高峰，2009-2011年主峰發生在3-6月份，2012-2017年主峰發生在3-7月；2010、2016和2017年無明顯次峰，其余年份次峰發生在9-11月，次峰遠低于主峰。CVA16的時間分布特征與其它病原相似，但發病高峰時間較EV71 和其他腸道病毒提前一個月。由于3-6月氣溫逐漸回暖，降雨多，濕度大，有利于手足口病毒繁殖生存，易出現高發。隨著8月暑期放假，幼兒減少了在托幼機構密切接觸機會，發病曲線出現明顯回落。9月開學，學生返校，再次增加了接觸傳播的機會。12月至2月為全年最低氣溫期，發病率大幅降低。

對江蘇省120株CVA16型分離株進行VP1基因核苷酸測定和分析，該120株CVA16毒株的VP1基因核苷酸與氨基酸序列同源性分別為87.5%～100%和 97%～100%。與A基因型和B基因型各亞型B1a、B1b以及B2株VP1區核苷酸同源性分別為74.1%～77.1%、88.3%～98.7%、88.1%～98.4%和87.1%～91.1%；氨基酸同源性分別為89.2%～92.3%、97.3%～100%、96.3%～100%和98.3%～100%。根據以上核苷酸和氨基酸序列同源性分析結果可知，CVA16分離株核苷酸序列變異較大，但氨基酸同源性較高，推斷存在一定的同義突變。對CVA16分離株VP1區氨基酸序列變異位點分析發現，第23位氨基酸位點為變異頻繁區域，有65株CVA16分離株發生了L→M的突變，其次是第218位點，有7株CVA16分離株發生了N→G的突變。上述突變在輕癥和重癥病例中呈現無規律散在分布，提示上述突變位點與CVA16引起的臨床差異無關。

2009-2017年120株CVA16江蘇省分離毒株與原型株G-10株及國外地區分離株遺傳距離較遠，親緣關系遠，與國內地區分離株的遺傳距離近，親緣關系近。提示江蘇省CVA16分離株在進化上并不是獨立的，而是與國內地區的CVA16同進化共循環的。VP1基因序列的進化分析顯示，引起江蘇省HFMD的120株CVA16分屬于B1a亞型和B1b亞型，其中B1b亞型為優勢流行基因亞型。推測進化樹上這兩簇的形成可能與其進化來源有關。輕癥,重癥在進化樹上無規律散在分布，提示CVA16引起的臨床差異可能與VP1區的基因序列無關。

本研究通過對2009-2017年江蘇省HFMD流行情況和CVA16的分子流行病學特征及其基因特征進行分析。對疫苗使用前后江蘇省CVA16的流行趨勢和病原學變遷進行連續監測，為本省HFMD的有效防控提供基礎資料。

利益沖突：無