基于線粒體Cytb序列的伯氏肩孔南極魚群體遺傳結構初步分析

趙 娜，馬春艷，宋 煒，馮春雷，王魯民，張鳳英，蔣科技，趙憲勇，馬凌波

(1. 中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090; 2. 上海海洋大學,上海 200090;3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島 266071)

在大約5億9千萬年前的前寒武季后期，超級大陸岡瓦納還包括南極洲、非洲、南美洲、澳大利亞、印度和阿拉伯半島[1]。自中生代晚期，劇烈的大陸板塊活動使得超級大陸岡瓦納開始逐漸解體，幾個大洲開始分離開來，到了新生代時期南極大陸經過緩慢的漂移，逐漸到了現在的地理位置[2]。在南極大陸逐漸漂移的過程中，整個南極大陸的氣候開始逐漸變冷，慢慢被冰雪覆蓋[3-4]。南大洋的水溫在南極大陸逐漸漂移過程中，水溫不斷降低，許多生物走向滅絕，僅有少數能夠適應低溫的生物存活了下來，南極魚類為了適應低溫環境，種群進行了相應的改變，生物多樣性也發生了改變。南極大陸被南大洋分割開來，環繞南極的南極繞極流( Antarctic Circumpolar Current, ACC)，阻礙了南極海域與其它海域的聯系，對南極魚類的種群遺傳具有一定的影響。

南極魚類在始新世到現在的4000萬年內發生了顯著性的變化[5]。雖然南大洋僅僅占了全世界海洋面積的10%，現有的魚類有322種[6]。伯氏肩孔南極魚(Trematomusbernacchii)屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)，鱸形目(Perciformes)，南極魚亞目(Notothenioide)，南極魚科(Notothenioidei)，肩孔南極魚屬，是一種廣泛分布于南極附近的適應寒冷環境的魚類，因其在寒冷條件下的適應性機制和自適應輻射具有重要的科學研究價值以及其經濟價值而引起了世界范圍的關注[7]。目前，關于伯氏肩孔南極魚遺傳多樣性、遺傳分化和種群歷史動態等方面的研究報道較少。本研究采用mtDNA細胞色素b(Cytb)基因序列的分析技術，研究分析了南極地區伯氏肩孔南極魚的種群遺傳結構及其多樣性與種群歷史動態，以期為更好地保護該魚種野生種群、促進其資源的可持續利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的伯氏肩孔南極魚分別采自位于羅斯海(LSH)、凱西站(KXZ)、長城站(CCZ)、戴維斯站(DWSZ)和中山站(ZSZ)的5個采樣點(表1)。樣品采集的時間、地點以及數量見圖1與表1。樣品采集后先對樣品進行形態鑒定，在-20 ℃條件下冷凍保存運回到實驗室。

表1 伯氏肩孔南極魚的采集樣品數Tab.1 Sample number of Trematomus bernacchii in each location

圖1 伯氏肩孔南極魚取樣地點圖Fig.1 Sampling sites of Trematomus bernacchii注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis station，ZSZ:Zhongshan Station

1.2 伯氏肩孔南極魚mtDNA Cytb 序列的擴增與測序

取伯氏肩孔南極魚背部肌肉或鰭部約100 mg，使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京，天根生化科技有限公司)提取總DNA。

1)Cytb引物使用自行設計的引物如下所示：

CF1/R1：CCGAAACTGTCCTTGGTGTGAG、GAGTGAGGGTGGCGTTATCTAC

CF2/R2：ACCTCCCCGCTCCATCTAAT、TACCCCCCCAAGTTTGTCTG

CF3/R3：AGGGGGGTTTTCGGTAGATA、TTTAGGGTCCTGGGGGCTTC

2)PCR在25μL的反應體系中執行，其中包括：

2xTaqPCR Master-Mix 12.5 μL

上游引物(10mmol·L-1) 1 μL

下游引物(10mmol·L-1) 1 μL

模板DNA 1 μL

去離子水 9.5 μL

3)PCR反應條件為：

預變性 94℃ 5min；

變性 94℃ 30s

退火 54℃ 45s

延伸 72℃ 1min；

第二階段循環35次

總延伸 72℃ 7min

PCR產物經電泳檢測質量和大小后，由JIE LI BILOGY進行正向測序。

1.3 數據分析

利用Clustal X[8]對序列進行對位排列, 并結合人工核查與校正。單倍型數目及分布、核苷酸多樣性使用DnaSP 5.1[9]軟件確定。用MEGA 5.1[10]軟件按照Kimura-2-parameter[11]進化模型來構建單倍型鄰接關系樹, 系統樹的可靠性采用1000次重復抽樣評估，并計算群體內的遺傳距離。

使用Arlequin 3.1[12]軟件的分子變異分析[13](AMOVA)來評估群體間遺傳變異，通過1000次重復抽樣來檢驗不同遺傳結構水平上的協方差的顯著性，按樣本的地理來源將5個群體分為1個組群，并采用Exact檢驗檢測單倍型在兩兩群體間分布頻率的差異來評價群體間的遺傳分化[14]。上述分析均由Arlequin 3.1軟件計算，群體間的遺傳距離采用Kimura-2-parameter模型計算。

2 結果與分析

2.1 序列變異特征分析

本實驗共得到了5個群體98尾伯氏肩孔南極魚的線粒體，Cytb基因全序列長度為1 141 bp，無堿基的插入與缺失，轉換替代明顯多于顛換，大多數變異發生在密碼子第3位(79.73%)，第1位(10.81%)和第2位(9.46%)的變異較低。其突變位點為75個，變異比率為6.57%，其中單一信息位點47個，占4.12%，簡約信息位點28個，占2.45%。4個堿基A、T、C和G的平均頻率分別為20.6%、32.4%、26.7%和20.3%，其中G的堿基含量低于其它3種堿基含量，A+T(53%)的出現頻率高于C+G(47%)，表現出了其堿基組成具有偏向性。

2.2 單倍型在群體中的分布及遺傳關系

98個個體中共檢測到27種單倍型，所得單倍型已全部提交到GenBank，登錄號為(MF664438～MF664464 )。伯氏肩孔南極魚27種單倍型在5群體中的分布如表2所示。群體間共享單倍型4個，占單倍型總數的14.81%，剩余23個均為某個群體所特有，在共享單倍型中Hap2為5個群體所共有，Hap4為4個群體所共有(除羅斯海外)，Hap7為凱西站和戴維斯站所共有，Hap23為凱西站和中山站所共有，各個站點存在共享單倍型，說明其親緣關系較近，各地理種群具有一定的基因交流，是一個隨機交配的群體。伯氏肩孔南極魚5個群體的遺傳多樣性數據見表3，98尾伯氏肩孔南極魚的單倍型多樣性為0.685 90±0.002 36，核苷酸多樣性為0.002 59±0.013 43，遺傳多樣性較高。核苷酸多樣性分析表明(表3)中山站核苷酸遺傳多樣性較高，大于0.004。

2.3 種群遺傳距離與遺傳分化

從5個伯氏肩孔南極魚地理群體的遺傳距離(表4)來看，群體內的平均遺傳距離在0.001 254～0.010 199，群體間的平均遺傳距離在0.001 733～0.007 140。結果表明，5個群體間的平均遺傳距離與群體內的平均遺傳距離處于同一水平。

表2 伯氏肩孔南極魚27種單倍型在5個群體中的分布及其分子系統樹Tab.2 Distribution of 27 haplotypes among 5 Trematomus bernacchii populations and its NJ molecular phylogenetic tree

注:節點數字表示大于50%的Bootstrap支持率;CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站

Note:Numbers at nodes indicate bootstrap values greater than 50% with 1000 replicates;CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis Station，ZSZ:Zhongshan Station

表3 不同群體伯氏肩孔南極魚的遺傳多樣性參數Tab.3 Parameters of genetic diversity of different populations of Trematomus bernacchii

注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站

Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis station，ZSZ:Zhongshan Station

在群體遺傳學中兩兩之間的遺傳分化指數一般分布在-1～1之間，遺傳分化系數(Fst)越大表示群體間的分化程度越高[15]。伯氏肩孔南極魚的5個群體間的Fst在-0.002 450～ 0.190 380之間(表4)，5個群體間的遺傳分化水平較低(Fst= -0.018 300～0.190 380，P>0.05)。AMOVA分析表明大部分的遺傳變異來自于種群內部，只有少數遺傳變異來自于種群之間，并且Φstatistics為正值。Exact檢驗表明，單倍型在群體間分布頻率的差異顯著(P=0.001 96)，說明其種群之間存在基因交流。

2.4 中性進化分析

5個伯氏肩孔南極魚群體的中性檢驗分析結果見表3。Tajima’s D檢驗的結果表明除戴維斯站(DWSZ)外均為負值，凱西站(KXZ)為極顯著差異(P<0.01)，中山站(ZSZ)顯著性差異(P<0.05)，其它群體均為不顯著差異(P>0.05)。中山站(ZSZ)顯著的偏離突變-漂變平衡(P<0.05)，凱西站(KXZ)極顯著的偏離突變-漂變平衡(P<0.01)。

圖2 基于K-2-P遺傳距離的伯氏肩孔南極魚5個群體之間的UPGMA樹Fig.2 UPGMA tree of 5 Trematomus bernacchii populations built under K-2-P genentic distance注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis Station，ZSZ:Zhongshan Station

群體PopulationKXZLSHCCZDWSZZSZKXZ 0.001 9800.001 830 0.001 733 0.003 104 0.005 875LSH0.039 640 0.001 254 0.001 7350.003 221 0.005 912CCZ0.190 380 0.097 110 0.010 1990.003 031 0.005 851DWSZ -0.002 450 0.156 2800.071 790 0.001 6590.007 140ZSZ0.011 1500.011 940 0.013 940-0.018 300 0.004 584

注:CCZ:長城站，LSH:羅斯海，KXZ:凱西站，DWSZ:戴維斯站，ZSZ:中山站

Note:CCZ:Great Wall Station，LSH:Ross Sea，KXZ:Casey Station，DWSZ:Davis Station，ZSZ:Zhongshan Station

表5 伯氏肩孔南極魚群體遺傳差異的 AMOVA 分析Tab.5 Analysis of molecular variance (AMOVA) among populations of Trematomus bernacchii

Fu’s 檢驗凱西站(KXZ)、羅斯海(LSH)和戴維斯站(DWSZ)群體為正值，長城站(CCZ)和中山站(ZSZ)群體為負值，且除凱西站(KXZ)外其余均無顯著性差異(P>0.05)，Fs值的顯著性表明凱西站極顯著的偏離突變-漂變平衡(P<0.01)，Fs是負值，并且顯著的偏離中性(P<0.05)，則有可能是群體擴張導致的。伯氏肩孔南極魚群體的D值和Fs均為負值，且具有極顯著的差異(P<0.01)，因此可以推斷出其可能經歷了種群的快速爆發與擴張事件。

2.5 歷史統計分析

將本實驗中的5個群體進行錯配分析，得到不同的頻率分布形狀圖，展現了伯氏肩孔南極魚群體的種群歷史多樣性，其中SSD和Raggedness值較大且不存在顯著差異(P<0.05)。群體擴張參數τ為1.723 74，參考線粒體Cytb的進化速率為每百萬年0.9%～1.2%，伯氏肩孔南極魚的性成熟年齡為8年[16]，根據公式T=τ/2u，得到該種群的擴張時間大約為9.84-10.49萬年前，大約是中更新世時期，該時期氣候寒冷，有冰期與間冰期的明顯交替[17]。

3 討論

3.1 遺傳多樣性

通過研究Cytb的完整序列基因分析了南極地區5個伯式肩孔南極魚地理群體的遺傳多樣性，研究結果以在一定的程度上反映伯氏肩孔南極魚資源的遺傳背景。有些群體數量較少，主要是由于南極魚類比較難獲取樣本，統計分析表明用于群體分析數量最少為5個，5個樣本即可以對數據進行溯祖分析[18]。測序后得到的序列長度為1 141 bp，無堿基的插入與缺失，轉換替代明顯多于顛換，大多數變異發生在密碼子第3位(79.73%)。整個群體單倍型多樣性較高(H=0.685 90±0.002 36)、核苷酸多樣性較低(Pi=0.002 59±0.013 43)的模式，這種模式揭示其出現過種群瓶頸效應[19]，這與在銀鯧(Pampusargenteus)[20]、松江鱸(Trachidermusfasciatus)[21]、小黃魚(Larimichthyspolyactis)[22]等研究中得到的結果相似。相比同生活在南大洋的物種來說，如南極東部沿岸貝氏肩孔南極魚(H=0.994，Pi=0.012 71)及尼氏肩孔南極魚(H=0.978，Pi=0.004 58)，都與伯氏肩孔南極魚群體有著相似的遺傳多樣性。貝氏肩孔南極魚和尼氏肩孔南極魚都屬于GRANT等[19]劃分的第二類遺傳模式，而高H低Pi的現象是由于有效種群數量較少，此后經歷一個快速的擴張期，積累了較多的變異，然而仍未積累大量序列變異造成[23]。在冰期魚類可能面臨惡劣的環境導致種群數量下降經歷瓶頸期，冰期之后由于環境適宜，種群呈現爆炸式擴散，快速積累遺傳變異，因此伯氏肩孔南極魚是一個大的隨機交流的群體。

圖3 不同站點的伯氏肩孔南極魚群體之間的錯配分析Fig.3 Mismatch distribution of populations of Trematomus bernacchii from different sites注:a，凱西站；b，羅絲海；c，長城站；d，戴維斯站；e，中山站Note:a，Casey Station；b，Ross Sea：c，Great Wall Station；d，Davis Station；e，Zhongshan Station

3.2 遺傳結構與分化

從魚類對環境的適應能力、對生態的適應性進化能力以及對自然選擇的效應等方面能分析出種群的遺傳結構[24]。伯氏肩孔南極魚的NJ樹顯示，該種群是一個隨機交配的群體，5個群體間的遺傳分化水平較低(Fst= -0.018 30～0.190 38，P>0.05)，不存在顯著的遺傳分化現象，遺傳距離相近，即不存在地理分布的譜系，這與UPGMA樹得到的結構一致并與大多數的海洋性魚類在非常廣泛的地理范圍內不存在顯著的遺傳差異的結果一致[19,25]。產生此現象的一個主要原因可能是由于南大洋存在南極繞極流，有助于伯氏肩孔南極魚魚卵的擴散，各個群體之間可以進行交流。魚類在屬、種和種群3級水平上的遺傳距離值分別為0.9、0.3和0.05[26]。5個群體之間的遺傳距離在0.001 252～0.009 991之間，均小于0.05，表明其采樣點之間的分化尚未達到種群水平。AMOVA分析的結果也同樣顯示了變異主要來自種群內部，而整個大的群體中不存在分化現象。

3.3 種群的歷史動態分析

種群在歷史上所經歷的變化主要是通過單倍型多樣性與核苷酸多樣性來推測，根據GRANT等[19]提出的歷史事件的4個假設來看，伯氏肩孔南極魚線粒體Cytb基因屬于第2種類型，這一類型的種群在歷史過程中發生過瓶頸效應或者奠基者效應，在此之后由一個小的群體迅速擴張與爆發。Tajima’sD和Fu’s檢驗結果顯示在凱西站出現了極顯著差異(P<0.01)，其余群體無顯著性差異(P>0.05)，這可能與樣本本身較難獲取，數量上有所差異，導致結果存在差別。5個群體除羅斯海外其余采樣點在錯配分析圖中均有小的峰值出現，可能預示了在這些地區存在一個比較年輕的祖先系統，值得注意的是羅斯海這一采樣點無此現象，可能是由于除了本身環境中的南極繞極流的存在，該地區的洋流還存在自身的漩渦現象，還需要進一步的實地考察。根據公式得到該種群的擴張時間大約為9.84～10.49萬年前，大約是中更新世時期，該時期氣候寒冷，有冰期與間冰期的明顯交替，氣候條件的變化使整個群體經歷瓶頸效應后擴張群體存活下來。

Exact檢驗結果表明了5個群體之間無顯著的遺傳分化，是一個可以隨機交配的群體，但是Cytb完整序列分析結果顯示不能簡單地把南極地區作為整個單一種群進行管理，必須結合其它分子標記技術如SSR、AFLP、SNP等全面檢測伯氏肩孔南極魚群體的遺傳結構，從而為漁業管理措施的制訂提供支撐。

伯氏肩孔南極魚分布較為廣泛，本研究由于樣本數量的問題及遺傳背景資料的缺乏，結果尚不能全面反映伯氏肩孔南極魚的遺傳特征，今后研究中需要增加樣本數量，并結合核基因標記聯合分析伯氏肩孔南極魚的種群遺傳與分化。