Cr6+對牙鲆仔幼魚的急性毒性效應研究

崔劍斌，孫朝徽，趙雅賢，任建功，張曉彥，王桂興，都 威，侯吉倫,宮春光，王玉芬

(1. 河北農業大學海洋學院， 河北秦皇島 066100； 2. 中國水產科學研究院北戴河中心試驗站， 河北秦皇島 066100)

在過去的幾十年中，隨著工業化進程的不斷加快，海洋和江河的水污染現象日趨嚴重，很多污染源含有大量的重金屬離子，造成水體的重金屬污染[1]。重金屬污染具有一定的不可逆性，具有毒性大、持續時間長、微生物不可降解、易在生物體內富集的等特點，已對水生生物造成了巨大威脅[2-4]。Cr6+是水環境中重要的重金屬污染物之一，是一種在多器官、多系統中都具有很強蓄積性的毒物[5]。水體中Cr6+的來源主要是工業生產中經常應用的鉻化合物，例如鉻鐵冶煉、耐火材料、電鍍、制革、顏料和化工等工業生產。其中應用最廣泛的重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，是一種有毒且有致癌性的強氧化劑，被國際癌癥研究機構(IARC)劃歸為第一類致癌物質。

在人類和其它哺乳動物中，關于Cr6+的毒理學和毒性效應已經有諸多的研究[6]。但在水生生物中，相關研究開展的相對較少，且僅集中在鳙 (Aristichthysnobilis)[7]、鯉 (Cyprinuscarpio)[8]、泥鰍(Misfurnusangullicaudatus)[9-10]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[11]等淡水魚以及日本黃姑魚(Nibeajaponica)[12]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[13]等海水魚中。吳迪等[10]研究了重鉻酸鉀對二倍體和三倍體泥鰍鰭細胞的氧化損傷、微核形成以及金屬硫蛋白表達情況的影響，結果顯示，二倍體細胞的半致死濃度、酶活力都低于三倍體細胞，對Cr6+更為敏感，可用于鉻污染的研究和監測。

本研究以我國重要的海水養殖魚類牙鲆(Paralichthysolivaceus)為對象，開展Cr6+對牙鲆的急性毒性效應研究。以期為深入了解Cr6+對海水魚類的毒性機理、客觀評價其對海洋生物的潛在風險以及準確鑒定和處理其所造成的海洋與漁業污染事故提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗魚為一個牙鲆連續兩代減數分裂雌核發育家系。所用仔魚為孵化后20日齡，平均體長(1.05±0.09 cm)，平均體質量(0.11±0.03 g)；幼魚平均體長(22.42±3.71 )cm，平均體質量(92.65±9.82 )g。實驗開始前，挑選健壯、無病無傷、無畸形、大小均勻的個體，移入300 L圓水槽中飼養。仔魚飼養3 d，幼魚飼養7 d，每一個水槽的試驗魚無任何死亡方可用于實驗。正式實驗開始前24 h，試驗魚停止投喂。

1.2 實驗用水及配置

重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司生產。實驗前稱取一定量的重鉻酸鉀, 用去離子水將重鉻酸鉀配成含Cr6+質量濃度為10 g·L-1的母液。實驗時再以經過兩次沙濾的海水稀釋成所需濃度的實驗溶液。實驗期間，水溫范圍為(18.5±0.5)℃，pH 范圍為8. 1～8. 3，鹽度為31. 0， 硬度為6200 mg·L-1，溶氧不低于5 mg·L-1。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗

參照GB 13267-1991《水質物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》進行實驗[14]，采用靜水生物測試方法。通過預實驗確定仔魚和幼魚Cr6+的濃度范圍。正式實驗按照等對數間距法分別設5個濃度梯度處理，其中仔魚所設置的濃度梯度為25.00、32.92、44.16、59.22、80.00 mg·L-1；幼魚所設置的濃度梯度為280.00、324.00、374.00、433.00、500.00 mg·L-1。每一系列另設置1個空白對照，每個梯度設4個平行(其中3個為試驗組，1個為采樣組)。實驗所用容器，仔魚為1000 mL的大燒杯，幼魚為300 L圓水槽。每個容器中試驗魚為20尾。整個實驗持續96 h，實驗開始后10 h內連續觀察試驗魚的活動情況，隨時撈出死亡個體，每24 h更換溶液一次，并分別在第24、48、72 、96 小時記錄試驗魚的存活情況。整個實驗期間，不投喂餌料。

1.3.2 試驗魚死亡的判定

當用玻璃棒觸碰牙鲆幼魚時，無任何肉眼可見運動，如無鰓扇動，失去呼吸能力；碰觸尾柄后、毫無反應；或者魚體失衡腹部向上，身體僵直，即判定為死亡個體。

1.3.3 血涂片制備及核異常觀察

取牙鲆幼魚外周血于潔凈的載玻片上，涂片，每尾魚至少制作5張涂片。涂片晾干，甲醇固定法10 min，15% Giemsa染液染色15 min, 自來水沖洗, 自然晾干。置于油鏡下觀察, 每片隨機觀察統計2000 個以上紅細胞, 記錄具有核異常的細胞數。核異常率(‰)為具有核異常的紅細胞數占所觀察的紅細胞總數的千分比。

1.3.4 組織切片與觀察

實驗開始后24、48、72、96 h，分別對幼魚各濃度進行解剖，將鰓組織塊用波恩氏液固定24 h后，隨后移入70%酒精保存。對經固定的組織塊進行梯度乙醇脫水、 二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度4 μm)和HE染色。所制備組織切片用Leicai DM2500進行觀察和拍照。

1.4 統計分析

統計平均死亡率，換算成概率單位，按照Bliss法，求出概率單位和實驗溶液濃度的回歸方程，求出24、48、72、96 h半致死濃度LC50，以及各自的95%置信區間。計算公式為：

LC50=Lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]

式中，Xm為最大劑量的對數值，i為相鄰兩組比值的對數，p為各組死亡率，∑p為各組死亡率之和。

按照Turubell法計算安全濃度(safety concentration,SC)[15]。計算公式為：

不同處理組間的紅細胞核異常率采用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析，并用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 牙鲆的中毒癥狀

牙鲆仔魚和幼魚在Cr6+暴露中各處理組均表現為由集群變為分散。低質量濃度組的試驗魚沿容器底部緩慢游動; 高質量濃度組的試驗魚進入水槽后顯得十分不安, 上升到水面沿池壁轉圈游動，一段時間后伏在池底靜止不動。隨染毒時間的延長，各處理組均出現魚體色變黑、粘液分泌增多、 鰓及腹部有輕微充血的現象，以及失去平衡，游泳能力和呼吸能力減弱。

2.2 Cr6+對牙鲆仔魚和幼魚的急性毒性

從表1可以看出，牙鲆仔魚在不同濃度Cr6+中暴露24 h后均出現死亡，死亡率在(3.33±2.89)%至(43.33±7.86)%之間，顯著高于對照組，且各濃度處理組之間差異顯著(P≤ 0.05)。隨著暴露時間和濃度的增加，累計死亡率有明顯的增加。96 h后，25.00 mg·L-1組的累計死亡率為(35.00±5.18)%，而最高濃度80.00 mg·L-1的累計死亡率達(98.33±2.89)%。

牙鲆幼魚在500 mg·L-1處理組暴露24 h出現大量死亡，累計死亡率達90.00%；而其它處理組的累計死亡率在1.65%～16.65%之間。到48 h，500 mg·L-1的試驗魚全部死亡。其它濃度處理組在48 h至96 h，也呈現出隨時間和濃度的增加累計死亡率升高的趨勢。433 mg·L-1死亡率高達95.00%，且未死亡的3尾試驗魚活力微弱。

2.3 Cr6+對牙鲆的半致死濃度及LC50值

死亡率換算的概率單位和試驗液質量濃度對數的回歸方程，以及各時間點的LC50值和95%置信區間見表2和表3。Cr6+對牙鲆仔魚的24、48、72、96 h半致死質量濃度分別為75.19、67.13、49.77、31.09 mg·L-1，安全濃度為16.05 mg·L-1；對牙鲆幼魚24、48、72、96 h 的半致死質量濃度分別為462.13、435.36、390.19、322.41 mg·L-1，安全濃度為115.91 mg·L-1。

2.4 Cr6+對牙鲆幼魚紅細胞核異常率的影響

在本試驗中，對照組正常紅細胞為橢圓形，其核位于細胞正中央，核膜清晰。在不同濃度Cr6+處理組中，可觀察到核變長、核內空泡、核變圓、核質斷裂、核不均等縊裂等異常(圖1)。不同濃度處理組的紅細胞核異常率結果如表4所示。對照組核異常率在不同處理時間之間差異不顯著(P>0.05)。而處理組的核異常率均顯著高于對照組，且總體上呈現質量濃度、處理時間—效應關系，即隨著Cr6+濃度增大、處理時間增加，紅細胞核異常率上升的趨勢。處理組中，核異常率最小值組為280 mg·L-1處理24 h，其值為(2.21±0.56)‰，為對照組的2.33倍；最大值組為433 mg·L-1處理96 h，其值為(10.13±1.23)‰，為對照組的9.56倍。此結果表明，Cr6+對牙鲆幼魚的紅細胞核具有明顯的損害作用。

表1 Cr6+對牙鲆仔魚和幼魚死亡率的影響Tab.1 Effects of Cr6+ on mortality of fry and fingerling of Paralichthys olivaceus

注：同一列不同小寫字母代表仔魚不同Cr6+濃度組間差異顯著(P≤0.05)；同一列不同大寫字母代表幼魚不同Cr6+濃度組間差異顯著(P≤0.05)

Note: Different lowercase letters within the same column represent significant differences between different Cr6+concentration groups of fry (P≤0.05); different capital letters within the same column represent significant differences between different Cr6+concentration groups of fingerling (P≤0.05)

表2 Cr6+對牙鲆仔魚的半致死濃度及其置信區間Tab.2 LC50 and confidence interval of Cr6+ to fry of Paralichthys olivaceus.

表3 Cr6+對牙鲆幼魚的半致死濃度及其置信區間Tab. 3 LC50 and confidence interval of Cr6+ to fingerling of Paralichthys olivaceus.

圖1 正常紅細胞和核異常紅細胞Fig. 1 Normal and nuclear abnormal erythrocyte of Paralichthys olivaceus注：a.正常紅細胞；b.核質延長；c.核內空泡；d.核變圓；e.核質斷裂；f.核不均等縊裂Note: a. Normal erythrocyte; b. Nuclear prolongation; c. Intranuclear vacuoles; d.Nucler rounding; e. Nuclear fracture; f. Unequal nuclear crack

Cr6+ 濃度/(mg·L-1) Cr6+ concentration異常率/‰ Abnormal rates24 h48 h 72 h96 h00.95±0.21Aa0.96±0.43Aa0.98±0.52Aa1.06±0.33Aa2802.21±0.56Ba3.58±0.77Bb5.11±0.37Bc6.89±0.62Bd3242.85±0.79Ba4.94±1.25Cb6.56±0.83Cc8.57±0.79Cd3743.27±0.33Ba5.79±0.81Db7.82±1.77Cb9.89±0.60Dd4334.05±1.13Ca7.18±1.73Eb9.92±1.05Dc10.13±1.23Dc5006.32±0.85Da9.65±1.77Fb——

注：同一列不同大寫字母之間代表差異顯著(P≤0.05)；同一行不同小寫字母之間代表差異顯著(P≤0.05)

Note: Different capital letters within the same column represent significant differences (P≤0.05); different lowercase letters within the same line represent significant differences (P≤0.05)

2.5 Cr6+對牙鲆幼魚鰓的損傷

牙鲆鰓的結構為硬骨魚類典型鰓結構，由鰓弓和鰓絲兩大部分組成。鰓絲上含有諸多上皮細胞和支持細胞。對照組鰓組織較完整，表面較干凈(圖2-A)。在各處理組，隨著處理濃度和時間的增加，鰓組織發生明顯病理性變化，且表現出質量濃度、處理時間—效應關系。以433 mg·L-1組為例，在暴露24 h后，鰓小片的上皮細胞層增生使鰓小片呈棒狀，鰓小片上泌氯細胞增多，但上皮細胞層的結果仍較完整(圖2-B)；暴露48 h后，鰓小片上泌氯細胞進一步增多，部分鰓小片的上皮細胞層與毛細血管分離形成空腔(圖2-C)；暴露72 h后，鰓絲末端一些部位甚至鰓小片基部的上皮層脫落，相鄰鰓小片的上皮細胞融合形成上皮細胞板；個別鰓小片頂端腫大呈球狀(圖2-D)；暴露96 h后，鰓組織結構被進一步破壞，鰓小片頂端腫大和上皮細胞層破裂程度加重 (圖2-E)。由此可見，Cr6+可對牙鲆鰓造成損傷，從而影響其機能。

3 討論

本研究得出Cr6+對牙鲆仔魚96 hLC50為31.09 mg·L-1，安全濃度為16.05 mg·L-1；對幼魚96 hLC50為322.41 mg·L-1，安全濃度為115.91 mg·L-1。根據國家環保總局所出版的《水和廢水監測分析方法》(第四版)[16]中所描述的魚類急性毒性分級標準(表5)，Cr6+對牙鲆仔魚的毒性屬于中等毒性，而對幼魚的毒性為低等毒性。Cr6+對黃顙魚的危害等級為中等毒性[11]，對日本黃姑魚[12]和鮸魚[13]的危害等級則為高毒。同一污染物在不同物種上具有不同的毒性效應，其潛在原因是多樣的。水體的溫度、pH、硬度、無機陰離子、絡合物以及魚體分泌物等物理、化學和生物因素會對實驗結果產生一定的影響[17]。另外，受試魚所處的發育階段的不同，采用胚胎、仔魚、稚魚還是成魚進行毒性實驗，也會對結果造成差異性影響。本研究采用牙鲆仔魚和幼魚開展實驗，兩者之間規格相差較大，所獲得的毒性等級也存在差異,從而為證實不同發育階段的實驗魚對結果會造成影響這一結論提供了證據。

表5 魚類急性毒性分級標準[16]Tab. 5 Classification standard of fish acute virulence

有觀點認為，在魚類中開展污染物的毒性效應研究，要盡量以仔魚為實驗材料，這樣可以避免因試驗魚過大導致的檢測毒性數據偏高的問題[11]。但如果單純就某一生長階段的魚開展毒性檢測，會造成所獲得的實驗數據過于單一，無法獲得系統性的毒性數據，也無法綜合的開展毒性評估。因此，為了系統全面的獲得相關污染物對魚體的毒性效應以及致毒機理，需要對處于不同生長階段的魚體開展染毒實驗，這樣獲得的數據才會更加全面和系統，才能更好的為對污染物毒性效應評估提供基礎數據。

鰓是魚類與外界水環境直接接觸的呼吸器官，其組織完整性對正常發揮功能以及魚體的健康存活具有重要意義。大量研究表明，金屬離子的過度暴露，會造成魚鰓諸如鰓小片上皮細胞增生和脫落、上皮細胞層與毛細血管分離形成空腔、上皮細胞層融合和壞死等損傷[18-20]。類似的損傷病變在本研究中均被觀察到，從一個側面證明了不同金屬離子對魚類鰓組織所造成損傷具有一致性。重金屬處理造成魚類鰓組織損傷的機理，可能是因處理導致魚體產生過多的自由基團，破壞了鰓的細胞結構，導致鰓中抗氧化活力下降，脂質過氧化物增加，從而造成鰓結構的改變[21]。但在另外一方面，這種損傷也是魚類對重金屬脅迫的一種自我保護機制，可有效減少魚體與重金屬的接觸，增加了重金屬脅迫環境下的生存幾率[22]。在以后的研究中，需要在分子層面上深入開展包含鰓在內的金屬離子對魚類組織器官損傷的機理研究，為全面系統的解析金屬離子的毒性機理奠定基礎。

圖2 牙鲆幼魚鰓組織切片Fig. 2 Histology sections of gill in fingerling of Paralichthys olivaceus注：A：對照組；B：433 mg·L-1處理24 h組(箭頭指泌氯細胞)；C: 433 mg·L-1處理48 h組(箭頭指空腔病變)；D: 433 mg·L-1處理72 h組(箭頭指頂端腫大病變，星號指空腔病變)；E: 433 mg·L-1處理96 h組(箭頭指頂端腫大病變)。比例尺=20 μmNote: A: Control; B: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 24 h (arrow indicates the chloride cell); C: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 48 h (arrow indicates the cavity); D: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 72 h (arrow indicates the apical swelling, asterisk indicates the cavity); E: Exposed to 433 mg·L-1 Cr6+ solution for 96 h (arrow indicates the apical swelling).Scale bar = 20 μm