熱脫附-氣相色譜/質譜聯用分析初榨橄欖油揮發性風味成分

雷春妮 周小平 高黎紅 金 鳳 解迎雙 馬 鑫 齊安安 宋亞娟 王慧珺

初榨橄欖油(virgin olive oil)是由新鮮的油橄欖果實直接冷榨而成，不經加熱和化學處理，完好地保存了最初的化學結構、天然營養成分以及原果實的口味和香氣，幾乎是世界上唯一的天然狀態冷餐植物油[1]。由于橄欖油具有極佳的天然保健功效、美容功效和理想的烹調用途而被公認為綠色保健食用油,素有“液體黃金”的美譽[2,3]。橄欖油特有的風味與其質量和經濟效益呈正相關，其含有的揮發物的種類、含量及相互間協調和抑制作用反映出的橄欖油風味在很大程度上決定其感官品質，并影響不同人群的消費行為，也能體現其在加工、儲藏等過程中的品質變化，可見研究橄欖油揮發性風味成分具有重要價值。

如何對風味成分進行提取是橄欖油香味分析的關鍵步驟，選擇適宜的提取方法關系到橄欖油風味成分定性及定量分析的準確性。目前，對于食用油風味成分的提取方法常見的有液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)、頂空法(Headspace,HS)和固相微萃取法(solid phase microextraction， SPME)[4-12]。此外，熱脫附法(thermal desorption，TD)作為一種新型的揮發性成分分析預處理方法，具備操作簡單，靈敏度高，綠色環保，檢測限可達到10-9級等優點，常見于環境、卷煙和植物揮發性物質的提取分析，以及少量應用于食品風味測定[13-17]，而至今尚無熱脫附法分析食用油揮發性風味成分的報道。

本實驗分別采用液液萃取法、頂空法、頂空固相微萃取法及熱脫附法對橄欖油的揮發性風味成分進行提取，采用MassworksTM質譜軟件結合氣相色譜-質譜法(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)對結果進行定性分析，彌補了常規GC-MS譜庫檢索定性的不足，并針對最佳提取方法進行了參數優選，旨在確定適宜橄欖油風味成分分析的最佳提取方法，為橄欖油風味的有效評價提供依據。

1 材料與方法

1.1材料與設備

樣品：選取瓦耶霍特級初榨橄欖油為1號(西班牙)、伯爵特級初榨橄欖油為2號(西班牙)、太平之選特級初榨橄欖油為3號(西班牙)、帆船牌特級初榨橄欖油為4號(西班牙)、得科特級初榨橄欖油為5號(意大利)、卡拉佩利混合橄欖油為6號(意大利)、卡拉佩利特級初榨橄欖油為7號(意大利)、巴基斯坦特級初榨橄欖油為8號(巴基斯坦)、PATEROMIIICHELAKIS特級初榨橄欖油為9號(希臘)、敘利亞特級初榨橄欖油為10號(敘利亞)、祥宇特級初榨橄欖油為11號(中國)。本實驗的橄欖油樣品均有甘肅隴南祥宇有限公司提供。

Agilent 7890A/5975C氣相色譜/質譜聯用儀；Clarus 600氣相色譜儀；AutoTD自動熱脫附解吸儀、AutoHS 自動頂空進樣器、集熱式恒溫加熱器、90 mm×6.4 mm不銹鋼采樣管(內裝150 mg Tenax-TA吸附劑)；手動固相微萃取裝置、萃取纖維頭(2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μmPA、100 μmPDMS)；SHC型純凈空氣泵。

1.2 分析方法

1.2.1 風味物質的提取方法

表1 風味物質的提取方法

注：“—”表示沒有采用進樣儀器。

1.2.2 氣相色譜-質譜聯用分析條件

色譜條件：色譜柱：HP-INNOWAX(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min的速率升至255 ℃，保持20 min；載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)；進樣口溫度：260 ℃；恒壓模式：10 psi；分流比：5∶1。

質譜條件：電子電離(EI)源；電子能量：70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：8 min；質量掃描范圍：m/z25～550 u。

2 結果與分析

2.1 提取方法的選擇

以祥宇特級初榨橄欖油為原料，選擇橄欖油揮發性成分的總峰面積、總峰個數作為分析依據，對提取方法進行優選。同一橄欖油樣品在不同的提取方式下獲得揮發性組分，儀器進樣參數一致，色譜圖在同一積分事件下獲得色譜圖峰面積和峰個數的數據，液液萃取法、頂空法、固相微萃取法、熱脫附法提取橄欖油揮發性組分對比結果見表2。如表2所示，頂空法對輕組分有所提取，對重組分幾乎沒有提取效果，色譜圖在12 min以后，基本沒有出峰，而峰面積和峰個數在四種提取方法中最低；液液萃取獲得的色譜圖在四種提取方法中響應最低，最高峰響應小于105 μV，不利于組分的鑒定分析，而所得峰面積和峰個數也顯著小于固相微萃取法和熱脫附法；固相微萃取法對輕組分的萃取效果較好，而對重組分萃取效果較差，色譜圖在30 min以后基本沒有出峰，且固相微萃取法由于其纖維萃取頭對揮發性組分的吸附具有特異選擇性，并不能全面反映樣品的揮發性成分組成；而熱脫附法在總峰面積和總峰個數上的提取效果均優于其他三種方法，并操作簡單，重復性好，提取所得的微量易揮發組分較多，能夠真實地反映樣品揮發性成分的構成。因而，選擇熱脫附法作為橄欖油風味成分的提取方法。

表2 不同提取方法對萃取效果的影響

2.2 熱脫附參數優化

對熱脫附參數的優化主要采用經氣相色譜分析得到的總峰面積及總峰面積與峰數的比值。總峰面積是由一些主要峰決定的,可以反映不同條件下主要峰的變化情況。總峰面積與峰數的比值能反映出萃取條件對所檢測到的峰數的影響,使優化過程能對那些量少的成分負責[18]。

2.2.1 吸附溫度

吸附溫度優化結果顯示(見圖1)，吸附溫度對樣品的吸附效率有很大影響，吸附溫度較低不利于香氣物質的釋放，但高的吸附溫度會造成香氣物質變化。吸附溫度為40 ℃與30 ℃相比較，總峰面積及總峰面積與峰數的比值有所提高，但各化合物間的相對比例和主要香氣物質基本一致。吸附溫度為 90 ℃與40 ℃相比較：總峰面積和總峰面積與峰數的比值顯著增高，但低分子量的醛類、醇類物質的相對含量有所降低，如正己醛在40 ℃時相對含量為19.022%，90 ℃時相對含量降低為1.693%；酯類、烯烴類、不飽和醛類物質的相對含量極速升高，如乙酸葉醇酯在40 ℃時相對含量為5.986%，90 ℃時相對含量升至12.400%；各化合物間的相對比例發生了改變，使主要香氣成分也發生了改變，可能過高的吸附溫度使揮發性組分發生了酯化反應和羥醛縮合反應，有待進一步確定。從檢測的效率以及檢測結果的全面性上考慮,宜采用40 ℃作為較佳的吸附溫度。此外，40 ℃接近人體體溫,測定的橄欖油樣品中揮發性組分的表現與其在人體感官系統中的表現有一致性。

圖1 吸附溫度對測定結果的影響

2.2.2 吸附時間

為了考察吸附時間對樣品揮發性組分富集的影響，本實驗選擇吸附時間0.5 h、1 h、2 h、3 h進行優化。從圖2可看出,隨著吸附時間的延長,吸附效果明顯提高。在0.5～2 h之間,總峰面積和總峰面積與峰數比值變化極顯著(P<0.01)。但在2～3 h,總峰面積及總峰面積與峰數比值基本持平,二者均在2h時達到最大值,之后保持不變,說明吸附劑在2 h便能吸附飽和。通過對色譜圖的分析,發現增加的峰大部分出現于保留時間24 min后,可能是由于這些物質具有較高的沸點,如果萃取時間太短,它們將來不及揮發而不被吸附,因此一定長的吸附時間對于它們顯得更為重要。大部分主要揮發物峰面積隨吸附時間的變化規律與總峰面積的變化規律一致,但有的比總峰面積達到穩定所需的時間短,如正己醛。綜合考慮,選擇吸附時間2 h為宜。

圖2 吸附時間對測定結果的影響

2.2.3 解吸溫度和解吸時間

解吸溫度及時間的選擇直接關系著被吸附物質從樣品管和冷阱管解析的程度。解吸溫度如果過低可導致目標化合物的解析不完全，不僅會影響方法的靈敏性,而且會污染后續樣品；如果溫度過高可導致吸附劑變性，減少使用壽命，影響吸附效果。在解吸溫度確定的條件下，解吸時間的長短決定了樣品解析是否完全、分析的準確度和靈敏度。本實驗對解吸溫度和解吸時間的考察方法為：在其他參數不變的情況下，改變解吸溫度或解吸時間參數進樣時，樣品管(樣品)后緊接已老化的空白采樣管(空白)，以公式：解析效率=樣品峰面積/(樣品峰面積+空白峰面積)×100%計算解析效率。綜合考慮檢測效率和檢測成本，確定較佳的參數為一級解吸溫度180 ℃；一級解吸時間5 min；二級解吸溫度280 ℃；二級解吸時間8 min。冷阱溫度是熱脫附冷阱聚焦功能的一個關鍵參數，冷阱低溫吸附并瞬間升溫解吸，降低了系統誤差，提高了分析的靈敏度，改善了譜帶展寬問題，在儀器條件允許范圍內，采用-30 ℃的冷阱溫度進行分析。

注：圖中峰號與表3的一致。

2.3不同品種油橄欖的初榨橄欖油中揮發性風味成分分析

按照優化后的熱脫附條件對初榨橄欖油揮發性成分進行GC-MS分離鑒定，得到初榨橄欖油香氣成分的總離子流圖(見圖3)。GC-MS譜圖利用NIST 11

表3 初榨橄欖油的揮發性風味成分鑒定結果及相對含量

標準譜庫檢索對揮發性組分進行初步定性，然后用MassworksTM質譜解析軟件對GC- MS譜圖進行校正，測定各組分的模擬精準分子量，結合相關文獻，對橄欖油揮發性組分進一步鑒定，最終得到橄欖油揮發性組分的定性結果，見表3。在11個初榨橄欖油樣品的香氣中共分離鑒定出22種化合物，按官能團的不同可以分為5大類物質，分別為：醇類(4.903%～32.424%)、醛類(20.476%～75.902%)、酯類(0.947%～13.769%)、酮類(1.905%～7.166%)、烯烴類(0.989%～11.981%),見圖4。

由表3可知，1號瓦耶霍特級初榨橄欖油分離鑒定出23種揮發性化合物，其中相對含量較高的組分

圖4 初榨橄欖油的揮發性風味成分分析

有乙酸葉醇酯(12.174%)、葉醇(12.095%)、反-2-己烯醛(10.012%)、1-十三烯(8.751%)；2號伯爵特級初榨橄欖油分離出24種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(20.87%)、乙酸葉醇酯(10.849%)、葉醇(10.040%)、正己醛(7.936%)；3號太平之選特級初榨橄欖油分離出22種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(17.114%)、葉醇(12.411%)、正己醇(10.325%)、反-2-己稀-1-醇(7.164%)；4號帆船牌特級初榨橄欖油分離出18種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(38.862%)、正己醛(13.453%)、3-戊酮(5.381%)、正己醇(5.067%)；5號得科特級初榨橄欖油分離出20種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(44.335%)、反-2-己稀-1-醇(8.303%)、葉醇(6.777%)、乙酸葉醇酯(6.620%)；6號卡拉佩利混合橄欖油分離出14種，其中相對含量較高的組分有正己醛(25.560%)、反-2-己烯醛(17.181%)、正己醇(7.101%)、反-2-己稀-1-醇(5.792%)；7號卡拉佩利特級初榨橄欖油分離出22種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(29.107%)、乙酸葉醇酯(10.938%)、正己醛(10.596%)、葉醇(7.976%)；8號巴基斯坦特級初榨橄欖油分離出21種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(23.737%)、正己醇(11.035%)、反-2-己稀-1-醇(7.021%)、檸檬烯(6.399%)；9號PATEROMIIICHELAKIS特級初榨橄欖油分離出23種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(35.052%)、正己醛(19.022%)、乙酸葉醇酯(5.986%)、反-2-己稀-1-醇(4.881%)、；10號敘利亞特級初榨橄欖油分離出21種，其中相對含量較高的組分有正己醛(38.341%)、反-2-己烯醛(27.830%)、壬醛(3.087%)；11號祥宇特級初榨橄欖油分離出21種，其中相對含量較高的組分有反-2-己烯醛(53.772%)、正己醛(8.575%)、葉醇(4.648%)、正己醇(4.047%)。

2.3.1 醇類化合物及風味

有8種醇類物質被識別出來，主要為C5和C6的化合物，這些化合物對初榨橄欖油的氣味特征有積極的貢獻[19]。在11種初榨橄欖油中相對含量較高的有葉醇(0.875%～12.411%)呈新鮮草葉的清香和蘋果青香、正己醇(0.425%～11.035%)有水果香氣及芬芳的風味、反-2-己烯-1-醇(1.474%～8.303%)呈清香型；此外，除1號瓦耶霍特級初榨橄欖油、4號帆船牌特級初榨橄欖油、6號卡拉佩利混合橄欖油、8號巴基斯坦特級初榨橄欖油外，其他7種初榨橄欖油中相對含量較高的還有1-戊烯-3-醇(1.246%～2.168%)呈水果香；1號瓦耶霍特級初榨橄欖油和6號卡拉佩利混合橄欖油中相對含量較高的有2-乙基己醇(2.791%～3.298%)，具有甜味和淡淡的花香，其他各醇類物質的含量相對較低。從文獻中得知，這些醇類化合物主要通過脂氧合酶途徑合成，包括酶的氧化、裂解(過氧化氫酶)；又通過醇脫氫的作用減少(醇脫氫酶)，由于葉醇需要較低的的脂肪氧合酶的活性，故其相對含量較高[20]。

2.3.2 醛類化合物及風味

8種醛類物質被鑒定出來，主要為C6、C7～C9的醛，而C6的醛則是對初榨橄欖油的氣味特征貢獻最大的物質[21]。C6的醛中反-2-己烯醛(10.012%～53.772%)、正己醛(5.323%～38.340%)在11種初榨橄欖油中相對含量較高，是初榨橄欖油水果香、青草香的主要貢獻者。其中，反-2-己烯醛則是相對含量最高的物質，應是初榨橄欖油中的主體香氣成分。反-2-己烯醛除通過脂氧合酶途徑產生外，還可經不穩定的反-3-己烯醛快速異構化為較穩定的反-2-己烯醛[20]。除4號、5號、7號、11號橄欖油外，其他7種初榨橄欖油中相對含量較高的還有壬醛(1.100%～3.349%)具有脂肪和柑橘的風味；4號相對含量較高的有Z-2-庚烯醛(1.993%)。6號相對含量較高的有辛醛(2.267%)、Z-2-庚烯醛(2.118%)，而同樣是意大利橄欖油的5號和7號中相對較低，甚至未檢出；此外6號橄欖油中未檢出2-己烯醛，其他10種橄欖油中均有檢出。辛醛在5號和11號橄欖油中未檢出，其他9種橄欖油中均有檢出；(E,E)-2,4-己二烯醛在1號、2號及6號橄欖油中未檢出，其他8種均有檢出。由上述分析可知：4個西班牙品牌(1～4號)中，4號主香氣成分反-2-己烯醛相對含量明顯高于其他三種；3個意大利品牌(5～7號)中，6號卡拉佩利混合橄欖油與5號、7號特級初榨橄欖油的醛類物質相對含量明顯有差異。醛的形成可以通過影響醇脫氫酶的活性進而進一步加快醇的分解，因此，醛在一定程度上可抑制醇的生成[22]。長鏈醛在所分析的樣品中的含量較低，據文獻報道這些化合物可被視為氧化標志物及樣品品質良好的表征[23]。

2.3.3 酮類、酯類和烯烴類各化合物及風味

酮類、酯類和烯烴類各化合物也是初榨橄欖油揮發性組分中的重要組成成分。酮類主要為C5的酮，有3-戊酮(1.119%～5.381%)和1-戊烯-3-酮(nd～0.786%)，一般對橄欖油的氣味具有積極的貢獻，3號、4號、6號、8號、9號橄欖油中未鑒定出1-戊烯-3-酮。酮存在于初榨橄欖油的香氣中其可能的原因是與果實中內源酶的活性相關[23]。酯類物質有乙酸己酯(nd～2.495%)和乙酸葉醇酯(0.681%～12.174%)兩種，其含量相對較低，這可能是由油橄欖果的成熟度所引起的；雖然酯類物質含量低檢測出的化合物少，但對初榨橄欖油的氣味特征能夠產生積極的影響，尤其對果香味這一屬性有積極的影響。除了以上來自脂氧合酶途徑的物質外，還有一些含量較低的烯烴類化合物，主要有檸檬烯(0.098%～1.678%)、Z-羅勒烯(0.560%～1.704%)和紫蘇烯(nd～1.214%)，現有文獻對這類物質的來源鮮有報道，故其來源需待進一步研究確定。

綜合分析可知，不同國家(西班牙、意大利、巴基斯坦、希臘、敘利亞、中國)的初榨橄欖油揮發性組分存在差異；同一國家(西班牙1～4號)的初榨橄欖油揮發性組分存在差異；同一國家不同等級橄欖油(意大利5號、6號)揮發性組分存在差異。初榨橄欖油揮發性組分很大程度上取決于油橄欖品種和產地，此外加工工藝不同也可能是造成揮發性組分差異的原因，有待進一步確定分析。

3 結論

3.1 熱脫附法相較于液液萃取法、頂空法及固相微萃取法，因其提取效果好，操作簡單，重復性好，對橄欖油中小分子、易揮發的微量成分不會造成破壞等優點，能夠更真實地反映樣品揮發性成分的構成，更適用于橄欖油揮發性風味成分的提取分析。

3.2 優化后橄欖油風味成分分析的熱脫附參數為：吸附溫度40 ℃；吸附時間2 h；一級解吸溫度180 ℃；一級解吸時間5 min；二級解吸溫度280 ℃；二級解吸時間8 min；冷阱溫度-30 ℃。熱脫附技術用于橄欖油香氣成分分析操作簡單，濃縮富集效率高，重現性好，其特有的冷阱聚焦功能，有效的改善了譜帶展寬的問題，提高了檢測的靈敏度，并通過兩級解吸充分釋放香氣成分，真實全面地反映了橄欖油香氣成分的構成。

3.3 TD-GC/MS法結合MassworksTM質譜解析軟件共鑒定出橄欖油揮發性成分26種，有醇類、醛類、酯類、酮類、烴類，協同作用共同體現出橄欖油特征性風味。經過分析得知，不同國家的初榨橄欖油揮發性組分存在差異；同一國家的初榨橄欖油揮發性組分存在差異；同一國家不同等級橄欖油揮發性組分存在差異。