醬香型白酒酒醅酶活性和輪次酒理化指標分析

戴奕杰，李宗軍*，田志強

（1.湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙410128；2.貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽550016）

隨著對中國白酒不斷的深入研究，微生物及其酶系的作用關系被認為是不同香型白酒風味特征形成的重要因素。醬香型白酒獨特的釀造工藝形成了其特殊的微生物區系，這些微生物產酶及代謝活動相互作用，最終形成了白酒特殊風味物質。因此，將微生物與其產酶種類及含量結合，是目前研究白酒的風味、酒質和產酒率的主流方向[1]。蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、單寧酶、脂肪酶等構成醬香型白酒的水解酶系[2-4]。一般而言，淀粉酶和蛋白酶主要是由細菌和霉菌產生，而糖化酶主要是由霉菌產生[5-8]。現階段，研究者們傾向于將產酶量高的菌株應用于強化大曲的制備[9]。

醬香型白酒的理化指標是鑒定輪次酒是否發酵成熟的標準，反映著醬酒的品質高低。張健等[10-11]研究發現，理化指標中總酸與白酒香氣強度和協調性呈強正相關，化學指標（總酸、總酯）對白酒的香氣品質的影響比較大，物理指標（白利糖度、電導率和黏度）影響很小。堆積過程中，網羅的微生物不斷繁殖代謝，使糟醅品溫不斷升高，與此同時，各輪次的物質成分逐漸被消耗使其輪次酒的酯、酸、酒精度、固形物等理化指標也在不斷變化。輪次酒由于釀造條件的不同而風格質量各異。

本研究從下沙階段開始到七輪堆積發酵結束，分別在起窖和下窖階段采集酒醅樣本，檢測其酶活性，并記錄在此期間七輪次酒的酒精度、總酸、總酯等理化指標。探究微生物多樣性、酶系、理化性質之間的關系是如何影響醬香型白酒酒質的，對白酒釀造機理的闡明和釀造工藝的改進具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅的采集

按照傳統醬酒的釀造工藝，在貴州某酒廠釀造過程中進行采樣。選取整個醬香白酒發酵工藝的下沙、糙沙和七輪次發酵過程的高溫堆積、窖池發酵工序的糟醅，取樣方法：對高溫堆積和窖池發酵酒醅的上、中、下層進行取樣，各層面進行3個重復，共9個抽樣點。將上述采樣位點的樣品破碎并混勻后，分裝于無菌袋封裝標記，冷凍保存。樣本信息如表1所示。

表1 酒醅樣本采集信息Table 1 Information of fermented grains sample

1.1.2 輪次酒的采集選取上述發酵過程所產的輪次酒進行采樣，對七個輪次酒熟糟上甑蒸酒取酒，每瓶500 mL的容量。編號為6、9、12、15、18、21、24的樣本依次對應為第1～7輪次的熟糟上甑蒸酒取酒。

1.1.3 試劑

糖化酶檢測試劑盒：上海雙贏生物科技公司；α-淀粉酶檢測試劑盒：西班牙博士泰公司；纖維素酶檢測試劑盒：西寶生物科技（上海）股份有限公司；蛋白酶檢測試劑盒：上海撫生實業有限公司；酯化酶檢測試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；果膠酶檢測試劑盒：合肥萊爾生物科技有限公司；單寧酶檢測試劑盒：上海紀寧實業有限公司；脂肪酶檢測試劑盒：上海通蔚科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BP211D電子分析天平：北京賽多利斯公司；LC-20AD高效液相色譜儀：日本島津公司；pHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；Epoch酶標儀：美國Biotek公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋、202型電熱恒溫干燥箱：北京市永明醫療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中酶系測定方法（1）樣本的前處理

準確稱取酒醅樣本各10g，放入裝有無菌攪拌珠的90mL生理鹽水中，60 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，期間不停攪拌，用濾紙過濾后得到過濾液，用于酶活性分析測定。

（2）酶活性的測定

應用雙抗體夾心法（酶聯免疫分析）測定樣本中的8種酶的酶活水平。

用純化的酶抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入酶，再與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的酶抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的酶濃度呈正相關。用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度（OD450nm值），通過標準曲線計算樣品中酶活性，以U/g醅以及mIU/g醅計（后文分別以U/g和mIU/g表示）。1.3.2 輪次酒的理化指標測定方法

輪次酒的酒精度、總酸、總酯、固形物的含量測定參照國標方法GB/T 10345—2007《白酒分析方法》測定，采用氣相色譜內標法進行分析，各指標要求如表2所示。

表2 輪次酒理化指標要求Table 2 Physical and chemical indexes requirements of each round Baijiu

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒釀造中酶活性變化規律

醬香白酒生產過程中各主要酶活測定結果見表3，其變化規律見圖1～圖8。

從大處說，如何改進和消除產品的“非功能性缺陷”，是供給側改革的一個重要領域；從小處講，如何將產品和服務的細節提升，是質量經濟、創新經濟的必答題。

表3 醬香白酒生產過程中各主要酶活Table 3 Main enzyme activities in the production of sauce-flavor Baijiu

（1）發酵過程中脂肪酶活性的變化

由圖1可知，整個發酵進程中脂肪酶活力呈現階梯性緩慢下降的趨勢，從下沙堆積時最高值（82.75 U/g）下降到第7輪次起窖時最低值（55.69 U/g），中途在三輪次下窖時達到76.26 U/g，僅次于下沙堆積。脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，它可作用于甘油三酯的酯鍵，使甘油三酯降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸[12]。醬香酒生產過程中脂肪酶可以作用于微生物的代謝產物，生成酒體風味物質的前體，后經過多重復雜的生化反應進而轉化為醬香呈香物質。

圖1 脂肪酶活性隨發酵過程的變化Fig. 1 Changes of lipase activity with fermentation process

（2）發酵過程中酯化酶活性的變化

由圖2可知，酯化酶活力在整個釀造工序中處于較為平穩的變化趨勢，其中在二輪次下窖時達到最高值（790mIU/g），后均維持較高的數值并伴有小幅下降，直降到五輪次起窖時的713 mIU/g；酯化酶活力最低值在兩個時間段出現，一個是二輪次起窖時（508 mIU/g），一個是七輪次起窖時（506 mIU/g）。酯化酶可直接將酸與醇催化合成酯類，包括同時合成中國白酒中重要物質己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯類。酯類物質是醬香白酒中所檢出化合物組分中種類最為豐富的一種，所以酯化酶在醬香白酒釀造過程中起著極其重要的作用。由圖亦可以看出，在烤酒質量最佳的第3、4、5輪次酒醅中的酯化酶活力均較高，這也在一定程度上體現出了酯化酶所起到的重要作用。

圖2 酯化酶活性隨發酵過程的變化Fig. 2 Changes of esterase activity with fermentation process

（3）發酵過程中果膠酶活性的變化

由圖3可知，果膠酶在整個醬香酒釀造工序中活性變化忽高忽低，無明顯規律性。最高值（94.45 U/g）出現在二輪次起窖時，最低值（41.81 U/g）出現在七輪次起窖時。釀造過程中霉菌為主要功能微生物，而果膠酶產生菌株主要為曲霉，所以推測醬酒酒醅中果膠酶是由其中豐富的霉菌代謝產生的。果膠酶主要可以作用于釀酒原料中的果膠物質，最終生成半乳糖醛酸，該物質可作為多種微生物的碳源，進入反應體系被轉化為酒體中的呈味組分[13]。（4）發酵過程中蛋白酶活性的變化

圖3 果膠酶活性隨發酵過程的變化Fig. 3 Changes of pectinase activity with fermentation process

由圖4可知，蛋白酶活力隨釀造工序進程呈現先上升后下降的趨勢。下沙堆積初始蛋白酶活力為51.30 U/g，隨后緩慢上升，至三輪次下窖時達到最高值（79.40 U/g），后迅速下降至七輪次起窖時達到最低值（33.80 U/g）。蛋白酶在醬香白酒釀造過程中起著關鍵性作用，其可以催化原料中的蛋白質及多肽水解，游離出多種氨基酸，而氨基酸可以進一步參與到反應體系中生成酸類、酯類、醛酮類、吡嗪類等化合物，所以其是重要的醬香前體物質[14-15]。釀造過程中細菌、酵母、霉菌均可以分泌出蛋白酶，保證了蛋白酶的來源及活性。

圖4 蛋白酶活性隨發酵過程的變化Fig. 4 Changes of protease activity with fermentation process

由圖5可知，單寧酶活力在整個釀造工序中大體上呈現先上升后下降的趨勢，期間忽高忽低，最高值出現在二輪次下窖時，為824 U/g，最低值為七輪次起窖時，為344 U/g。單寧酶主要為霉菌和酵母分泌產生，可降解原料中的單寧物質和蛋白質[16]，一方面可以降低酒體澀味感，一方面還可以生成多種中間代謝產物進入到后續反應中，為醬香風味的形成提供物質基礎。（6）發酵過程中纖維素酶活性的變化

圖5 單寧酶活性隨發酵過程的變化Fig. 5 Changes of tannase activity with fermentation process

由圖6可知，纖維素酶活力自下沙堆積開始整體處于上升趨勢，直至五輪次起窖時達到最高值（1 806.50 mIU/g），后迅速下降至六輪次起窖時的1 055.90 mIU/g，后有所回升。纖維素酶活力在3～5輪次糟醅中均處于較高值。纖維素酶可由細菌和真菌分泌產生，以木霉、曲霉、青霉產量最為豐富，所以具有豐富霉菌體系的糟醅中纖維素酶活力旺盛[17-19]。纖維素酶可以降解釀酒原料中的纖維素成分而生成葡萄糖，一方面提高了原料的利用率，一方面也為微生物發酵提供基質。

圖6 纖維素酶活性隨發酵過程的變化Fig. 6 Changes of cellulose activity with fermentation process

（7）發酵過程中糖化酶活性的變化

由圖7可知，糖化酶活力在整個釀造工序中均處于較高的水平，總體呈現先上升后下降的趨勢，在二輪次起窖時達到最高值（2 020 mIU/g），后緩慢下降，直降至七輪次起窖時的1 365 mIU/g，在中間輪次（3～5輪次）時雖沒有達到最高值，但是總體較為平穩。釀酒原料中小麥、高粱均具有高含量的淀粉，糖化酶能直接作用于淀粉或是其他多糖，將其轉化為葡萄糖，是釀造過程中重要的酶類[20-21]。糖化酶的分泌主要是酵母和霉菌代謝產生，醬香酒醅中豐富的微生物區系為保證糖化酶活力提供了前提基礎。

圖7 糖化酶活性隨發酵過程的變化Fig. 7 Changes of glucoamylase activity with fermentation process

（8）發酵過程中α-淀粉酶活性的變化

由圖8可知，α-淀粉酶活性由下沙堆積時的417.65 U/g緩慢上升，一輪次下窖時達到第一個階段高點（555.70 U/g），后緩慢下降又上升至三輪次下窖時的590.70 U/g，整體上下浮動的趨勢不是很顯著，這為發酵進程提供了較為平穩的淀粉酶活性。淀粉酶主要是將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、寡糖、少量麥芽糖和葡萄糖，使淀粉黏度迅速下降達到液化目的，降低了原料的粘韌度，為后續的微生物利用原料起到促進作用，加速發酵進程[22]。

圖8 α-淀粉酶活性隨發酵過程的變化Fig. 8 Changes of α-amylase activity with fermentation process

2.2 理化指標及酒質鑒定

由表4可知，七個輪次的新酒中檢測出酒精度、總酸、總酯及固形物的含量，酒精度、總酯和固形物指標隨輪次的增加而逐漸降低，含量最低的為七輪次酒。總酸則呈現忽高忽低的變化。對照《仁懷大曲醬香酒技術標準體系》[23]的標準，七輪次酒的各項目含量均符合“一級”指標要求。其中，第三、第四、第五輪次酒無論是總酸還是總酯的含量均達到“優級”標準。第一、第二、第六輪次酒則總酸含量為“一級”，而總酯含量為“優級”。整體指標結果顯示，優質酒呈現于中間輪次（3～5）中。

表4 輪次酒理化指標檢測結果Table 4 Determination results of physical and chemical indexes of rounds Baijiu

3 結論

結果表明，糖化酶活性整體呈現先上升后下降趨勢，且前期在窖池發酵階段酶活增強，在堆積發酵階段酶活性減弱，后期的輪次則相反。果膠酶酶活性表現為各輪次樣本堆積下窖時高于窖池發酵起窖，推測果膠酶活性與堆積有一定的聯系。因此，研究醬香型白酒酶系和微生物產酶關系為優化制曲工藝和制備強化大曲提供了理論依據。

白酒的理化成分分析結果表明，總酸在各輪次酒中呈現上下浮動，先下降后上升再下降；酒精度、總酯和固形物指標隨輪次的增加而逐漸降低并趨向穩定，可能與各種中間物質在微生物及酶的作用下產生及消耗有關。其中，第三、第四、第五輪次酒的酒質最優，結合酶活性變化，初步揭示了醬香型白酒的質量高低與釀酒微生物菌群有關。目前白酒的風味研究大量集中在主要特征風味的探索，明顯忽略了此部分的研究，應當在特征風味探尋的同時，從整體上評價各風味物質的貢獻度。