恩施市3種泡辣椒樣品中細菌多樣性研究

尚雪嬌，折米娜，鄧長陽，廖 華，趙 楠，郭 壯，4*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽441053；2.恩施市農業局，湖北 恩施445000；3.四川省農業科學院 農產品加工研究所，四川 成都610066；4.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施445000）

泡辣椒是一種流行于四川、湖南和貴州等地區的傳統發酵辣椒產品[1]，其主要利用辣椒表面附著的微生物自然發酵而成[2]。由于傳統發酵食品制作環境開放，使得各類產品中的微生物具有多樣性[3]。鐘燕青[4]研究發現，湖南地區自然發酵剁辣椒中的乳酸菌主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和短乳桿菌（Lactobacillus breris），同時沙漠等[5]從自然發酵的辣椒醬中分離出兩株產酸量高、生長良好且適用于發酵辣椒試驗的菌株，分別為L.plantarum和腸膜串球菌（Streptococcus faecalis）。周俊良[6]在貴州地區市售泡辣椒和農家自制醬辣椒產品中篩選出4株適用于發酵辣椒制品制作的乳酸菌，分別為雙發酵乳桿菌（Lactobacillus bifermentans）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）和食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans），然而關于湖北恩施地區泡辣椒中微生物多樣性的研究報道尚少。

相對于傳統微生物培養方式，Illumina MiSeq第二代高通量測序技術可以獲得不同環境條件下微生物的群落結構，不僅能夠檢測到低豐度的微生物，而且具有很高的可信度和準確度[7]。同時聚合酶鏈式反應結合變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）是一種新型且不依賴于培養的分子生物學技術，其可以直接提取微生物的宏基因組，通過電泳圖來檢測和鑒定自然環境或人工環境中微生物的種類[8]。Illumina MiSeq技術和PCR-DGGE技術改善了傳統微生物培養方法中耗時長和工作量大等缺點，同時具有快速和簡便且重復性好的特點，被廣泛應用于發酵食品[9-10]、肉制品[11-12]、腸道[13-14]和土壤[15-16]微生態研究等領域。

因此，本研究采用MiSeq高通量測序技術與PCR-DGGE技術相結合的方法對恩施地區3種泡辣椒中微生物的多樣性進行解析，同時利用傳統微生物純培養方法及分子生物學技術對其中所含的乳酸菌進行分離鑒定。以期全面解析恩施市傳統發酵辣椒中細菌的多樣性，同時對恩施地區發酵食品中乳酸菌的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

3種泡辣椒樣品（編號分別為LJS01、LJS02和LJS03，泡制時間均在30 d左右）：采購于恩施市土橋壩菜市場。

1.1.2 試劑

三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MRS培養基：青島海博生物技術有限公司；D5625-01脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA marker、PCR清潔試劑盒：京科博匯智生物科技發展有限公司；2PCR×mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq酶（5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、pMD18-T vector：大連寶生物技術有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Top10感受態細胞：鄂西北傳統發酵食品研究所自制；PCR引物合成由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成，引物信息如表1所示。

表1 本實驗采用的引物信息Table 1 Information of primers used in the experiment

1.2 儀器與設備

MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務器：美國DELL公司；CT15RE冷凍離心機：日本HITACHI公司；VeritiTM96-well thermal cycler PCR儀：美國AB公司；NanoDrop 2000/2000c超微量分光光度計：美國Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem：美國Bio-Rad公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡辣椒樣品宏基因組提取與檢測

采用OMEGA D5625-01試劑盒提取3種泡辣椒樣品的宏基因組，采用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并用NanoDrop超微量分光光度計測定其DNA的濃度。

1.3.2 泡辣椒樣品細菌16S rRNA PCR擴增及MiSeq高通量測序

參照沈馨等[17]的方法對泡辣椒樣品中細菌的16S rRNA基因進行PCR擴增及MiSeq高通量測序。PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4.0 μL，dNTP mix 2.0 μL，正反向引物338F/806

R各0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，無菌超純水補充至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30次循環；72℃再延伸10min。其擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后將濃度稀釋至100 nmol/L，寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列拼接及質量控制

參照周書楠等[18-19]的方法，根據成對序列之間的重疊關系，將雙端序列拼接成一條序列；其次根據barcode將所有序列劃分到各個樣品并對序列方向進行校正，最后切除序列的barcode和引物。使用QIIME v1.7.0分析平臺對拼接及質控成功的序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分和物種鑒定（包括界、門、綱、目、科和屬水平），并計算各分類單元的相對含量。

1.3.4 泡辣椒中乳酸桿菌多樣性解析

對乳酸桿菌的16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，正向引物（LacF-GC）、反向引物（LacR）和rTaq各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，無菌超純水補充至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環30次；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

使用8%聚丙烯酰胺凝膠、變性劑梯度為35%～52%的變性劑（尿素和去離子甲酰胺）進行DGGE。電泳溫度為60 ℃，電泳緩沖液為0.5×TAE，上樣量為10 μL，120 V條件下運行80 min后，80 V條件下運行13 h。電泳結束后，對凝膠進行硝酸銀染色，對DGGE圖進行觀察、掃描、拍照并找出優勢條帶切膠回收。回收的PCR擴增產物用不含GC夾子的引物LacF和LacR進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件與上述方法相同。將清潔的PCR擴增產物與pMD18-T載體連接后轉化到E.coli Top10感受態細胞中，經單克隆鑒定合格后送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。將測序結果除去兩端載體的序列，然后使用BioEdit軟件進行拼接，拼接后在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進行同源性比對，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.5 泡辣椒中乳酸菌的分離與鑒定

將泡辣椒樣品進行倍比稀釋并涂布于含有1.0%碳酸鈣的MRS固體培養基上，置于厭氧工作站37 ℃恒溫培養48 h。挑取有透明圈的單菌落進行純化、革蘭氏染色和保藏。采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[20]提取各菌株的DNA，以其為模板進行16S rRNA PCR擴增。在張魯冀等[21]的方法上稍作修改，PCR擴增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，正向引物（27F）、反向引物（1495R）、rTaq酶和DNA模板各0.5 μL，無菌超純水補充至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將清潔的PCR擴增產物按照方法1.3.4處理并對測定結果進行拼接和比對。

1.3.6 數據處理

通過Origin 8.5軟件對平均相對含量＞1.0%的細菌屬進行柱狀圖的繪制，維恩（Venn）圖由在線網站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行繪制。利用BioEdit軟件和MEGA 5.0軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 基于MiSeq高通量測序技術泡辣椒細菌多樣性的研究

3種泡辣椒樣品中共產生了131 480條16S rRNA高質量序列，平均每種樣品產生43 826 條16S rRNA高質量序列。根據100%的相似性進行序列劃分共得到78 050條代表性序列，根據序列的97%相似性進行OTU劃分后，共得到8 879個OTU，每種樣品平均得到2 959個OTU。使用Ribosomal Database Projec（tRDP）和Greengenes數據庫對序列進行同源性比對，將所有的序列鑒定為10個門、18個綱、42個目、82個科和177個屬。

在門水平上，3種泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為85.70%和12.59%。在屬水平上，有10.88%的序列不能被鑒定，其中平均相對含量＞1.0%的屬如圖1所示。

由圖1可知，泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和明串球菌屬（Leuconostoc），其平均相對含量分別為67.37%、7.69%、1.99%、1.16%、1.08%和1.02%。由此可知，隸屬于Firmicutes的Lactobacillus為泡辣椒中的優勢屬。利用MiSeq高通量測序方法，韓俊燕等[20]對發酵辣椒中微生物多樣性進行分析，結果發現Firmicutes為所有樣品的優勢細菌門，其含量＞50%，進一步研究得知，Lactobacillus和Weissella為優勢細菌屬。JUNG J Y等[22]使用454 GS FLX Titanium測序系統發現韓國泡菜中主要的細菌屬為Leuconostoc、Lactobacillus和Weissella。

圖1 泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌屬Fig. 1 Bacterial genera with average relative abundance more than 1.0% in the pickled chili samples

在OTU水平上，進一步統計OTU在3種泡辣椒樣品中出現的頻率，結果如圖2所示。

圖2 基于OTU水平的Venn圖Fig. 2 Venn diagram based on OTU level

由圖2可知，3種泡辣椒樣品中共有23個核心OTU，僅占OTU總數的0.2%，但包含了95 978條序列，占總序列數的73.0%。在23個核心OUT中，8個核心OTU在3種泡辣椒樣品中的平均相對含量＞1.0%，分別為OTU1140、OTU2282、OTU3351、OTU7763、OTU326、OTU227、OTU5266和OTU 7746。進一步構建了8個核心OTU的系統發育樹，結果如圖3所示。

圖3 泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%核心OTU的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of core OTU with average relative abundance more than 1.0% in the pickled chili samples

由 圖3 可 知，OTU1140 和OTU2282 與Lactobacillus acidifarinae聚為一類，OTU3351與Lactobacillus namurensis聚為一類，OTU7763和Lactobacillusparafarraginis聚為一類，OTU326與Lactobacillus kisonensis聚為一類，OTU5266和OTU227與Pediococcus ethanolidurans聚為一類，OTU7746與耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）聚為一類。由此可見，上述8個核心OTU中2個鑒定為Pediococcus，6個鑒定為Lactobacillus，因此，采集自恩施市的3種泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的核心菌群均為乳酸桿菌。

2.2 基于PCR-DGGE測序技術泡辣椒乳酸桿菌多樣性的研究

圖中L1～L5代表特異性條帶編號。圖4 泡辣椒樣品中乳酸桿菌PCR-DGGE結果Fig. 4 PCR-DGGE results of Lactobacillus in the pickled chili samples

由于本研究中MiSeq高通量測序的靶點主要針對16S rRNA的V3～V4區，所以其引物通用性較強，在種屬鑒定時通常僅將其鑒定到屬水平。本研究進一步使用乳酸桿菌專用引物對樣品中的乳酸桿菌屬進行了PCR擴增，并結合PCR-DGGE技術對其多樣性進行解析。泡辣椒樣品中乳酸桿菌PCR-DGGE電泳結果如圖4所示。

由圖4可知，在電泳圖中共找到5條特異性條帶，其中條帶L1、L2、L4是3種泡辣椒樣品的共有條帶，條帶L5存在于泡辣椒樣品LJS01和LJS03中，但是各條帶的亮度不一致，說明同種微生物在不同樣品中的含量存在差異，而條帶L3只存在于泡辣椒樣品LJS03中。由此可見，不同泡辣椒樣品間乳酸桿菌多樣性存在一定差異，且泡辣椒樣品LJS03中乳酸桿菌多樣性較高。進一步對各優勢條帶進行切膠回收和序列分析，結果如表2所示。

表2 DGGE中優勢乳酸桿菌序列比對結果Table 2 Sequence alignment results of dominant Lactobacillus in DGGE

由表2可知，5個特異性條帶的基因序列與NCBI中模式菌株的基因序列具有較高的相似度（99%～100%）。條帶L1為植物乳桿菌（L.plantarum），條帶L2為L.namurensis，條帶L3為發酵乳桿菌（L.fermentum），條帶L4為耐酸乳桿菌（L.acetotolerans），條帶L5為短乳桿菌（L.breris）。由此可見，恩施市泡辣椒中乳酸菌多樣性較高，采用純培養技術對其中蘊含的乳酸菌菌種資源進行挖掘顯得尤為必要。

2.3 泡辣椒中乳酸菌分離鑒定結果及系統發育分析

使用傳統微生物培養方法對3種泡辣椒樣品中的乳酸菌進行分離鑒定。從3種泡辣椒樣品中共分離得到14株乳酸菌，編號分別為LJS01-1、LJS01-2、LJS01-3、LJS01-4、LJS01-6、LJS01-7、LJS02-1、LJS02-2、LJS02-4、LJS03-1、LJS03-2、LJS03-3、LJS03-5和LJS03-6。將各菌株與NCBI中同源性較高的模式菌構建系統發育樹，結果如圖5所示。

由圖5可知，菌株LJS01-1、LJS01-3、LJS01-6、LJS01-7、LJS03-1、LJS03-5和LJS03-6與L.plantarum聚于一支，菌株LJS01-4、LJS02-2與L.fermentum聚于一支，菌株LJS02-1、LJS01-2、LJS02-4與屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚于一支，菌株LJS03-2和LJS03-3與香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）聚于一支。因此，14株乳酸菌經16S rRNA基因序列鑒定，7株為L. plantarum，2株為L. fermentum，3株為E.faecium，2株為L.farciminis。

圖5 14株菌株基于16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of 14 strains based on 16S rRNA gene sequences

通過純培養和分子生物學相結合的方法，本研究從泡辣椒樣品中分離出的乳酸菌主要為L.plantarum。利用傳統分子生物學及16S rRNA測序方法，王修俊等[23]在貴陽發酵辣椒中發現一株產酸能力較強、生長良好的優勢菌株，經鑒定為L.plantarum；葉陵等[24]從自然發酵剁辣椒中共鑒定出5株乳酸菌，其中3株為L.plantarum、2株為L.breris。

3 結論

恩施市3種泡辣椒樣品中優勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為85.70%和12.59%；優勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其平均相對含量高達67.37%。通過傳統微生物培養方法共分離鑒定出14株乳酸菌，其中7株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、2株為發酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）、3株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）、2株為香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis），表明優勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。