基于高通量測序技術分析牛欄山大曲微生物多樣性

王 勇，周 森，魏金旺*

（北京順鑫農業股份有限公司 牛欄山酒廠，北京101301）

牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒，憑借清香純正、口味甘冽、酒體醇厚等特點，逐漸成為我國北方清香型的代表性白酒之一，在國內具有較高的知名度[1-2]。牛欄山二鍋頭主要以大曲作為糖化發酵劑，經過糖化、發酵、蒸餾和儲存等步驟制得。大曲是二鍋頭釀造中的主要糖化劑，是富含微生物菌系、酶系和曲香物質的微生態制品，具有糖化、發酵、生香等功能[3]，是白酒中微生物的主要來源。然而傳統微生物分離方法對大曲中微生物的研究還有一定的缺陷，大曲中的微生物經過長期的馴化，早已適應了高溫、低含水量及不同pH值等特殊環境，而在人工培養模式下，由于培養條件難以完全模擬出大曲的制曲環境，往往會造成部分微生物無法正常生長，導致微生物可培養性不高等現象[4]。

目前，隨著分子生物學技術的發展及運用，人們對大曲微生物菌系的研究逐漸由傳統微生物分離轉變為依靠分子生物學技術的免培養方法。近幾年來，以基因文庫、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、高通量測序為主的分子生物學技術手段逐漸應用于大曲微生物的研究中，有效解決了純培養技術在微生物分離種類和數量方面的不足[5-8]，如羅惠波等[9]利用內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）基因文庫研究了清香型大曲真菌群落結構，確定出汾酒大曲真菌全部屬于酵母目和毛霉菌目，清茬、后火和紅心曲真菌群落結構存在明顯差異；蘭玉倩等[10]利用PCR-DGEE技術解析清香型大曲生產過程中酵母群落結構，確定了清香型大曲制作過程中存在7個真菌分類屬，并介紹了各屬微生物的變化規律；喬曉梅等[11]采用高通量測序法分析了清香大曲真菌群落結構，確定了清香大曲主要真菌類群。這些研究方法可以避免在傳統培養過程中富集、培養及分離等步驟中所造成的微生物多樣性丟失、種群構成發生變化等局限，能夠更直接可靠的反映樣品微生物的原始組成情況。

本研究采用高通量測序技術，利用免培養方法，從牛欄山大曲中原核生物和真核生物兩個方面入手，系統分析牛欄山大曲菌系組成，同時根據不同微生物所占比例關系，確定出了牛欄山大曲中主體微生物，為牛欄山大曲質量控制及制曲工藝提供一定的基礎數據，同時也為牛欄山大曲微生物分離純化等工作提供數據指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型釀酒生產大曲：取牛欄山不同釀酒班生產大曲，按“四分法”混合取樣[12]，用無菌封口袋封裝，-80 ℃保藏備用；土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）：美國Mpbio公司；DNA引物：北京天跟生化科技有限公司；冰乙酸（分析純）：北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

JY600型基礎型電泳儀：鄭州博邦科貿有限公司；ChampGelTM全自動凝膠成像儀：北京賽智創業公司；1-14k高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Illumina MiSeq測序儀：北京奧維森基因科技有限公司；0.45 μm過濾膜：Milipore公司；Milli-Q IQ7000超純水系統：美國Millipore公司；Fast-Prep-24 5G勻漿儀：美國MP Biomedicals公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大曲總DNA提取

從混合大曲樣品中隨機稱取6份（每份1 g），經Fastprep處理后，采用土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for SoiL）提取總DNA。

1.3.2 大曲高通量測序

大曲樣品中微生物種類繁多，真核微生物和原核微生物共存，因此本研究對大曲樣品總DNA的ITS1區和16S rDNA V3/V4區進行PCR擴增，擴增引物及反應條件見表1。

將6份大曲總DNA混合后，進行ITS1區和16S rDNA V3/V4區片段擴增，產物庫檢合格后，利用Illumina MiSeq PE300進行細菌、真菌高通量測序（北京奧維森公司）。原始測序序列通過Fastqc進行質量檢測去除低質量Reads（過濾標準：Q20≥90%）。通過Cope軟件（Connecting Overlapped Pair-End，V1.2.3.3），進行序列拼接及過濾后利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法（average neighbor clustering algorithm）在0.03（或97%的相似度）水平下對Clean Tags進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的聚類，統計各個樣品每個OTU中的豐度信息。選取分析數據中每個OTU中一個有代表性的序列，通過Blast比對，獲得每一個OTU種名。

表1 高通量測序引物序列Table 1 Primer sequences of high throughput sequencing

2 結果與分析

2.1 大曲微生物聚類分析

大曲總DNA經電泳檢測合格后，利用Illumina MiSeq PE300進行細菌、真菌高通量測序，根據97%相似度將不同測序序列進行聚類分析。經分析表明，從牛欄山大曲中共獲得真核OTU 69種，原核OTU 358種，說明牛欄山大曲中原核微生物多樣性遠高于真核。

2.2 大曲原核微生物多樣性

樣品中原核微生物358 種OTU 主要由放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4類組成，其具體分布見表2。

表2 大曲原核微生物分類Table 2 Classification of prokaryotic microorganism from Daqu

通過表2可以看出，大曲中厚壁菌門所占OTU數量最多，為46.65%，變形菌門和放線菌門分別為25.42%和21.79%，擬桿菌門數量最少，為6.15%。同時，對所獲得OTU進一步進行種屬分析，結果見圖1所示。

通過對358種原核OTU進行種屬比對，挑選OTU數占原核總OTU數1%以上的序列進行多樣性分析。如圖2所示，共有14種OTU占1%以上，其總和可占總OTU的83%，因此可以認為14種OTU能夠代表大曲主體原核微生物。

圖1 大曲原核微生物種屬分布餅圖Fig. 1 Species distribution pie chart of prokaryotic microorganism from Daqu

14種OTU的菌屬主要可分為乳酸菌、放線菌、芽孢桿菌、葡萄球菌這4大類，其中乳酸菌種類較多，由7種組成，放線菌、芽孢桿菌和葡萄球菌種類較為接近，均為2～3種。在種屬分布上，乳酸菌所占比例較多，維斯氏菌（Weissella confusa）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）和戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）分別占大曲總OTU的22.68%、16.54%和9.84%；放線菌（Kroppenstedtia eburnea）可在大曲中占14.78%；以地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）為主的芽孢桿菌僅占3.80%和2.14%。整體看來，牛欄山大曲中優勢原核微生物較為明顯，乳酸菌類在牛欄山大曲中占據了主導地位，同時含有一定量的高溫放線菌，而芽孢桿菌則在大曲中含量較低。在牛欄山酒釀造過程中，大曲中的大量乳酸菌進入到發酵過程中能夠為發酵微生物提供營養物質并維持發酵的平衡。目前已有研究表明，乳酸菌自身可以合成一類具有活性的多肽和蛋白質類物質，呈現不可逆的殺菌作用方式，有效地抑制酒醅中雜菌生長[14]，另外當乳酸菌和酵母菌共同發酵時，能夠有效地提高發酵樣品中的酸、醇、酯等風味物質產量；同時乳酸菌自溶所產生的營養物質可供酵母所利用，自溶后產生的酶類、活性成分和多種酸性多糖磷酸質，具有一定的糖化作用，在一定程度上提高了酒醅其余微生物對淀粉的利用[15-16]；并且其產生的多種有機酸是乳酸乙酯及其他香味成分合成的重要基礎物質。

2.3 大曲真核微生物多樣性

在本研究中，共獲得真核微生物OTU 69種，共分為9個目，其具體組成見表3。

通過表3可以看出，牛欄山大曲中酵母目OTU所占比例最多，達到了56.52%，其次為散囊菌目15.94%，毛霉菌目8.70%，其余類別所占比例相對較低。對所獲得OTU數據進一步進行種屬分析。通過對69種OTU進行種屬比對，挑選OTU數量前10的OTU進行系統分析，如圖2所示。

表3 大曲真核微生物分類Table 3 Classification of eukaryotic microorganism from Daqu

圖2 大曲真核微生物種屬分布餅圖Fig. 2 Species distribution pie chart of eukaryotic microorganism from Daqu

由圖2可知，在大曲真菌OTU中，前10種OTU總和可占大曲真菌總OTU的99.25%，因此可以認為這10種OTU能夠真實反映大曲中真菌的種屬分布情況。在大曲真菌種屬組成中，扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）數量最多，可占大曲真菌總量的73%，其次為庫氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）可占21%，兩種真菌共占大曲總量的94%，因此可以認為這兩種菌是牛欄山大曲的主體真菌，而其余真菌，如假絲酵母（Candida tropicalis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、橫梗霉（Lichtheimia corymbifera）以及異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等，雖然在大曲高通量中能夠檢測到，但所占比例較低，僅在1%以下，在大曲真菌中并不占優勢。扣囊覆膜酵母被認為是清香型大曲制曲前期的主要微生物，雖然其產酒精能力不強，但香味濃郁，可使白酒風味更加豐富，同時已有研究表明，扣囊覆膜酵母能產α-淀粉酶，能分解生料和熟料淀粉，也能產生糖化酶，將淀粉分解為葡萄糖[17-18]，說明扣囊覆膜酵母在制曲過程中可以利用生料淀粉產生糖化酶、淀粉酶，將原料中的淀粉轉化為葡萄糖，為大曲的正常制作提供多種糖類物質，同時也是成品曲中酶類的重要產生菌；庫氏畢赤酵母屬于生香酵母類，在產酯產香方面具有較強能力，能夠利用發酵環境中的糖類、氨基酸、蛋白質及醇類物質，在發酵前期生成大量以乙酸乙酯為主體的酯類及少量酸類、酚類等化合物，起到為基酒增香的重要作用[19-20]。

3 結論

本研究利用高通量測序技術，從分類學角度系統研究了牛欄山大曲真核和原核微生物多樣性分布，確定了大曲中菌系組成。結果表明原核生物在大曲中多樣性遠高于真核，共獲得358種原核OTU，而真核僅為69種。微生物種屬分布表明，大曲中原核微生物主要可分為乳酸菌類群、放線菌類群、芽孢桿菌類群和葡萄球菌類群，其中乳酸菌類群所占比例較高，維斯氏菌（W.confuse）、耐酸乳桿菌（L. acetotolerans）和戊糖片球菌（P. pentosaceus）3種乳酸菌總和可占大曲原核總OTU的49.06%，同時大曲中還存在一定量的高溫放線菌（K.eburnea）；在真核微生物組中，扣囊覆膜酵母（S.fibuligera）和庫氏畢赤酵母（P.kudriavzevii）是牛欄山大曲中的主要微生物，橫梗霉（L.corymbifera）、釀酒酵母（S.cerevisiae）及異常維克漢姆酵母（W.anomalus）、假絲酵母（C.tropicalis）所占比例較低。

大曲制作過程繁雜，培養周期長，在開放的環境中，其所包含的微生物種類十分豐富，制曲原料、器具、空氣均是大曲微生物的主要來源。牛欄山大曲采用了低溫制曲工藝，制曲溫度最高不超過40～50 ℃，適宜的溫度、制曲工藝及獨特菌群環境形成了牛欄山大曲特有的菌群結構。因此，對牛欄山大曲進行系統研究，將有助于解析出二鍋頭酒口味甘洌、酒體醇厚的原因，同時也可以為今后大曲的質控及強化制曲等提供基礎數據支撐。