紅曲茶黃酒多酚色譜分析及其對小鼠抗氧化酶活力影響

梁璋成，何志剛*，林曉婕，林曉姿，李維新

（1.福建省農科院 農業工程技術研究所，福建 福州350003；2.福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州350003）

紅曲黃酒是福建特產，含有多種生物活性物質[1-3]，如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷胱甘肽、多酚類物質與低聚糖等，具有降膽固醇、降血糖、降血壓和防癌等功能以及通血脈、厚腸胃、潤皮膚、散濕氣、養脾氣、扶肝、除風、下氣等醫療保健功效[4]，深受消費者喜愛。傳統工藝釀造的紅曲黃酒具有溫熱屬性，可以活血祛寒、通經活絡，能有效抵御寒冷，預防感冒，作為低度佐餐飲料酒，在冬季飲服深受消費者的歡迎，但若在夏季飲用，對熱性敏感體質人群，存在著易“上火”的體質表征等缺陷，也使紅曲黃酒的消費受到地域性和時間性的制約，不利于黃酒市場占有率的擴大，成為紅曲黃酒市場拓展的主要瓶頸之一[5]。為此，課題組研究了影響紅曲黃酒寒熱性的相關因子[6]，通過綠茶共發酵技術，研制出了溫和清爽型的紅曲茶黃酒，可顯著降低傳統紅曲黃酒的熱度，使黃酒熱性指數下降超過40%[7]。綠茶中含有豐富的茶多酚、茶多糖、生物堿、維生素等功能活性物質，發酵過程中水溶性及醇溶性營養物質溶于酒中，使紅曲黃酒的物質組成及其營養功效發生改變，使總酚含量提高30%以上[8]。已有研究表明，酚類物質的組分及含量對黃酒的抗氧化能力具有顯著的影響[9-11]。但引入綠茶共發酵對紅曲黃酒酚類物質組成與成分及其抗氧化能力的影響尚不明確。

血清內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是體內抗氧化的第一道防線，可將超氧陰離子自由基快速歧化為過氧化氫和分子氧[12]。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）具有清除氧自由基、保護細胞免受氧化損傷的作用，可將過氧化氫轉化為水和分子氧[13]。一般說來，體內SOD和GSH-Px酶活力越高，表明機體清除氧自由基的能力越強。氧自由基在體內的水平可以通過多種方式進行檢測，其中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量被認為是極為重要的指標[14]，血清中MDA水平代表了機體的膜脂質過氧化水平。因此，可選擇血清SOD 和GSH-Px酶活力和MDA含量作為評價小鼠抗氧化能力的核心指標。本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測紅曲黃酒酚類物質含量，酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒法檢測小鼠血清的抗氧化酶活力及丙二醛（MDA）含量，以傳統工藝紅曲黃酒為對照，考察添加綠茶共發酵對紅曲黃酒酚類物質及小鼠體內抗氧化酶活力的影響，以期為紅曲茶黃酒新產品的深入開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

傳統工藝紅曲黃酒（酒精度16%vol）：本實驗室自制；大米（永安圓糯米）、紅曲米（寧德市古田平湖紅曲米）：市售；發酵用水：寧德市蕉城區洋中天湖鳳尾山泉水；綠茶：寧德市蕉城區“天山綠”綠茶，色澤翠綠，有清鮮茶香，沖泡后湯色碧綠、清澈明亮，滋味濃厚回甘；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）JH301：由本實驗室自主選育并保存。

1.1.2 動物和飼料

清潔級美國癌癥研究所（institute ofcancer research，ICR）健康小鼠（雌雄各半，體質量（20±2）g），飼料：上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.3 化學試劑

表沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸兒茶素、咖啡因、兒茶素、綠原酸、沒食子酸、丁香酸、楊梅素、香豆酸、阿魏酸、香草酸、蘆丁、紫丁香酸（純度≥98%）：美國Sigma 公司；SOD、MDA、GSH-Px專用酶聯免疫試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均使用國產分析純。

1.2 儀器與設備

PB-10型pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；1260型高相液相色譜儀：美國Agilent 公司；UV-1750紫外分光光度計：島津（蘇州）儀器有限公司；DW-FL362型離心機：上海安亭科學儀器有限公司；KDM型調溫電熱套：山東華魯電熱儀器有限公司；酒精計：浙江余姚比重計廠；SPX智能型生化培養箱：寧波江南儀器廠；TE601-I電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；YXQ-LS-505II立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海

博訊實業有限公司醫療設備廠；陶土酒壇：寧德黃家酒業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲茶黃酒的制備

糯米經浸泡、蒸煮，以米飯∶水按照料液比1∶1（g∶mL）落缸，按總質量的5%接種古田紅曲米，按總質量的1.0%接種釀酒酵母JH301，按總質量的1.0‰加入綠茶，攪拌均勻后控溫（20±1）℃發酵40 d，壓榨、過濾，調整酒精度為（16±0.5）%vol，85 ℃熱滅菌15 min后陳釀（溫度20 ℃）6個月，備用。在落缸時不添加綠茶共發酵的處理即為傳統工藝紅曲黃酒。

1.3.2 動物模型試驗

將小鼠隨機分為5組，即正常組、傳統紅曲黃酒組、低劑量紅曲茶黃酒組（0.05 mL/10 g）、中劑量紅曲茶黃酒組（0.10 mL/10 g）、高劑量紅曲茶黃酒組（0.20 mL/10 g）。每組分3個平行組，每個平行組20只小鼠，即每組共60只小鼠。各組小鼠正常飼養1周作為適應期，之后按表1方案灌胃給藥并繼續飼養，每日上午1次，每次灌胃劑量為0.05 mL/10 g、0.10 mL/10 g、0.20 mL/10 g，灌胃造模90 d后檢測小鼠血清生化指標，考察添加綠茶發酵對紅曲黃酒抗氧化能力的影響。

表1 不同實驗組小鼠給藥方案Table 1 Dosage regimen of each experimental groups

中國居民膳食指南中推薦每人每日酒精攝入量≤25 g，傳統紅曲黃酒及紅曲茶黃酒樣品酒精度16%vol，折算成其每日攝入量不超過156.25 mL，以人平均體質量60 kg計，傳統紅曲黃酒及紅曲茶黃酒的人體日推薦量約為≤2.6 mL/kg。以10 倍人體推薦量為基礎來設定實驗組劑量，因此高、中、低劑量組分別設為20.0 mL（/kg·d）、10 mL（/kg·d）及5 mL（/kg·d）。

1.3.3 檢測方法

酚類物質的含量：采用高效液相色譜法測定[8]；總酚含量的測定：采用GB/T 21733—2008《茶飲料》[15]；咖啡因含量的測定：采用GB 5009.139—2014《飲料中咖啡因的測定》[16]。

小鼠SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量測定：從小鼠眼球采取血液，于4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，用移液槍取300 μL血清，裝于1.5 mL離心管中，使用SOD、MDA、GSH-Px專用酶聯免疫試劑盒檢測小鼠SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量。以每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位（U）；以每0.1 mL血清（漿）在37 ℃條件下反應5 min，扣除非酶促反應作用，使反應體系中GSH濃度降低1 mol/L為一個GSH-Px酶活力單位（U）。

1.3.4 數據處理

采用DPS6.01軟件處理，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 紅曲茶黃酒的酚類物質組分與含量

表2 綠茶對紅曲黃酒酚類物質成分與含量的影響Table 2 Effect of green tea on the phenols composition and content of Hong Qu Huangjiu

由表2可知，傳統紅曲黃酒的酚類物質主要為兒茶素、綠原酸、沒食子酸、丁香酸及楊梅素等。紅曲茶黃酒添加綠茶共發酵，綠茶中的水溶性及醇溶性營養物質溶于酒中，可豐富傳統紅曲黃酒酚類物質組分，增加綠茶特征酚類物質表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）和咖啡因，還可使傳統紅曲黃酒的主要酚類物質如兒茶素、綠原酸和沒食子酸的含量分別提高27.38%、29.52%和30.77%，使總酚含量提高37.69%。結果表明，添加綠茶共發酵不僅可極顯著提高紅曲黃酒酚類物質含量（P＜0.01），還可豐富紅曲黃酒的酚類物質組成，賦予紅曲黃酒綠茶的特征酚類物質。

2.2 紅曲茶黃酒對小鼠血清的SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響

表3 不同實驗組小鼠血清的SOD、GSH-Px活力及MDA含量Table 3 Activities of SOD and GSH-Px and MDA contents in serum of mice with different treatments

由表3可知，每天灌服0.20 mL/10 g紅曲茶黃酒的高劑量紅曲茶黃酒組小鼠出現了嚴重的死亡現象，故不統計其對小鼠抗氧酶活力的影響。結果表明，與灌服蒸餾水組小鼠相比，灌服傳統紅曲黃酒可分別使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力顯著提高5.08%和10.16%（P＜0.05），小鼠血清的MDA含量降低2.90%，說明傳統紅曲黃酒可提高小鼠的抗氧化水平；灌服低劑量紅曲茶黃酒可分別使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力顯著提高5.49%和11.77%（P＜0.05），小鼠血清的MDA含量顯著降低3.76%（P＜0.05），與灌服傳統紅曲黃酒組差異未達顯著水平（P＞0.05）；灌服中劑量紅曲茶黃酒可分別使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力分別顯著提高8.29%和23.93%（P＜0.05），小鼠血清的MDA顯著含量降低5.79%（P＜0.05），與灌服蒸餾水組、灌服傳統紅曲黃酒組和灌服低劑量紅曲茶黃酒組的差異均達顯著水平（P＜0.05）。與傳統紅曲黃酒相比，紅曲茶黃酒可顯著提高小鼠的抗氧化能力，使小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）酶活力分別提高3.05%和12.50%（P＜0.05），MDA含量顯著降低2.98%（P＜0.05）。灌胃劑量越大，紅曲茶黃酒的抗氧化能力就越強；但當灌胃劑量達0.20 mL/10 g時，小鼠出現了死亡現象。結果表明，添加綠茶共發酵可顯著提高紅曲黃酒的抗氧化能力。

2.3 討論

現代醫學研究已經證明，很多疾病如組織器宮老化等都與過剩的自由基有關。氧在生物體內通過單電子還原產生化學性質活潑的物質稱活性氧，它們包括超氧負離子自由基、過氧化氫和羥基自由基等。活性氧可以與DNA、蛋白質和多元不飽和脂肪酸作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯、蛋白-DNA交聯和脂質過氧化。體內也有各種消除活性氧和自由基的防御系統，以免組織遭到傷害，但當人體內出現各種各樣負荷狀態時，就會使活性氧和自由基的形成和消除之間平衡喪失，從而誘發各種組織損傷和疾病，引起如癌癥、衰老、心血管疾病等慢性疾病[17]。茶多酚是一種純天然抗氧劑，它是在茶葉水浸物中與亞鐵離子產生綜合反應的酚類化合物的總稱。綠茶中的茶多酚主要為兒茶素類化合物，主要包括表沒食子兒茶素（EGC）、DL-兒茶素（DL-catechin，DL-C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子酸酷（EGCG）等，均具有極強的抗氧化能力[18-20]。茶多酚能對自由基誘發的生物大分子損傷起到保護作用，能提高小鼠抗氧化酶（包括SOD、GSH-Px等）活性，有效阻止DNA由雜環胺引起的氧化損傷，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害[21]；茶多酚還可抑制自發性和Fe2+誘導性脂質過氧化，降低脂質過氧化程度和MDA含量[22-23]。因此，添加綠茶共發酵可顯著提高紅曲黃酒的抗氧化能力。與灌服傳統紅曲黃酒的小鼠相比，灌服紅曲茶黃酒的小鼠的SOD、GSH-Px活力顯著提高、MDA含量顯著下降。

3 結論

本研究結果表明，添加綠茶共發酵不僅可豐富傳統紅曲黃酒的酚類物質組分及含量，與傳統紅曲黃酒相比，小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力分別顯著提高3.05%和12.50%（P＜0.05），MDA含量顯著降低2.98%（P＜0.05）。飲用黃酒需達一定濃度的才可以增強機體的抗氧化能力、降低氧化損傷[24]，若劑量過低發揮的功效并不顯著，但劑量過高會導致小鼠死亡（灌胃劑量達0.20 mL/10 g時），適宜范圍仍需進一步研究證實。此外，紅曲茶黃酒的抗氧化能力與其所含抗氧化酚類物質的含量有關，其確切關系還需進一步深入研究。