降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其在發酵魚糜中的初步應用

劉 玉，鄭心茹，林偉言，陳 倩，蘇國成，蘇文金，周常義*

（1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門361021；2.廈門中集信檢測技術有限公司，福建 廈門361021）

魚糜制品是受眾多消費者青睞的一款魚類產品，目前我國的加工魚糜制品（如魚卷、魚餅、魚糕、魚丸等）已經有了一定的規模[1]，但天然腌制發酵的魚糜產品含有亞硝酸鹽，對人體有害。所以從生產過程中控制亞硝酸鹽的投放量，同時采用微生物降解的方式成為控制亞硝酸鹽含量的有效途徑之一[2]。

研究發現，將乳酸菌接種到魚肉中，亞硝酸鹽含量可以得到顯著的降解[3]，并且接種單一菌種的乳酸菌和接種復合菌種的乳酸菌效果是不一樣的[4]。乳酸菌降解亞硝酸鹽的方式分為酸降解和酶降解[5]。許女等[6]研究了19株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）降解亞硝酸鹽和生物胺的功能特性及相關基因的攜帶情況，篩選得到優良菌株并混合接種用于發酵青魚魚糜，發酵后的魚肉香腸中亞硝酸鹽、腐胺和尸胺的含量都明顯的降低；KIM H S等[7]研究了6種發酵劑對發酵香腸中亞硝酸鹽降解的影響，結果發現，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）等發酵可以消耗發酵香腸中殘留的亞硝酸鹽。因此，優化挑選具備高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌具有重要的實踐意義。

本研究以巴浪魚干為材料，從中分離篩選高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，采用生理生化試驗和分子生物學方法對其進行鑒定，并考察該乳酸菌的生長特性及最適降解亞硝酸鹽條件。以未添加乳酸菌的魚糜為空白對照，使用該乳酸菌發酵魚糜，采用單因素和正交試驗設計優化魚糜發酵條件，為工業化生產發酵魚糜產品控制亞硝酸鹽含量和提升產品品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

巴浪魚干（藍圓鲹干制品）：廈門市集美市場，采集后放在無菌的自封袋中，4 ℃保存；AAA金線魚魚糜：泉州龍富港水產品有限公司。

1.1.2 試劑

MRS固（液）體培養基：廣東環凱生物科技有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

PHX150生化培養箱：寧波萊福科技有限公司；BagMixer 400VW均質器：法國INTERSCIENCE公司；TP-1102/214電子分析天平、PB-10 pH計：德國賽多利斯公司；UV-2000紫外可見分光光度計：上海尤尼科儀器有限公司；TC-96/G/H（b）C基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；GenoSens1860凝膠圖像分析系統：上海勤翔科學儀器有限公司；SC-1212水平電泳槽儀：北京凱元信瑞儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離

在超凈工作臺取25 g巴浪魚干放入無菌均質袋，加入225 mL無菌生理鹽水磨碎均質，梯度稀釋，用接種環挑取10-2、10-4、10-6梯度稀釋液分別劃線于含1%CaCO3的MRS固體培養基，37 ℃厭氧靜置培養48 h[8]。選擇溶鈣圈較大且呈白色或乳白色的單菌落在MRS固體培養基上進行分離純化，直到長出較純的單個菌落。

1.3.2 生理生化試驗

對分離得到的與乳酸菌基本特征相一致的細菌菌落進行生理生化試驗[9]。

1.3.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

對分離得到的乳酸菌進行進一步篩選，獲得能高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌。初篩：將乳酸菌菌懸液（菌體濃度106CFU/mL）按5%（V/V）接種量接種至含有50 μg/mL亞硝酸鹽的100 mL MRS液體培養基中，37 ℃厭氧靜置培養，每隔12 h測定一次亞硝酸鹽含量[10]。復篩：將MRS液體培養基中的亞硝酸鹽質量濃度提高至100 μg/mL，其余步驟相同[11]。以未接種的空白MRS液體培養基作對照（CK），采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽含量[12]。

1.3.4 乳酸菌的分子生物學鑒定

對篩選得到的亞硝酸鹽降解能力最強的菌株進行分子生物學鑒定。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取乳酸菌DNA，以其為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增[13]，將PCR擴增產物送至廈門鉑金生物技術有限公司進行測序。使用BLAST程序將測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數據庫中進行同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株，使用MEGA 7.0分析軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹[14]。

1.3.5 菌株R6的生長特性研究

生長曲線的測定：按5%的接種量將菌株R6菌懸液接種于MRS液體培養基中，37 ℃厭氧靜置培養，每隔4 h取一定量的菌液并稀釋至合適的倍數，測定其OD600nm值[8]，測量至24 h為止。

培養溫度對菌株R6生長的影響：按5%的接種量將菌株R6菌懸液接種于MRS液體培養基中，分別在不同培養溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）條件下厭氧靜置培養18 h后，取一定量的菌液稀釋至合適的倍數，測定其OD600nm值[15]。

NaCl含量對菌株R6生長的影響：按5%的接種量將菌株R6菌懸液接種于不同NaCl含量（0、5%、10%、15%、20%、25%）的MRS液體培養基中，37 ℃厭氧靜置培養18 h后，取一定量的菌液稀釋至合適的倍數，測定其OD600nm值[15]。

1.3.6 不同發酵條件對菌株R6降解亞硝酸鹽能力的影響

按5%的接種量將菌株R6菌懸液接種于含有150 μg/mL亞硝酸鈉的100 mL MRS液體培養基中，并分別在不同發酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）和不同初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）的條件下培養。培養16 h和24 h分別取樣，以未接種的培養基作空白對照，檢測培養基中亞硝酸鹽的含量，研究發酵溫度和初始pH值對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響[10]。

1.3.7 發酵魚糜加工工藝

取冷凍魚糜于4 ℃半解凍后，將水分調整為80%，空擂5min，按魚糜質量添加3%食鹽和10%淀粉，繼續擂潰10min。對照組于30 ℃放置30 h，45 ℃水浴1 h后轉移至90 ℃水浴20 min[16]，加熱完成后立即置于冰水浴中冷卻，在4 ℃冰箱冷藏過夜。實驗組以菌株R6為發酵劑，在食鹽擂潰前按1%的接種量接種菌株R6（108CFU/mL），其余步驟與對照組相同。擂潰過程中應控制魚糜樣品溫度≤10 ℃[17]。

1.3.8 發酵魚糜工藝條件優化

單因素試驗[18]：采用單因素輪換法依次考察發酵溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、發酵時間（10 h、15 h、20 h、25 h、30 h）與發酵劑菌株R6接種量（0.5%、1.0%、1.5%）對魚糜中亞硝酸鹽降解的影響。對魚糜中亞硝酸鹽降解率進行測定[19]，亞硝酸鹽降解率計算公式如下：

式中：W0為發酵前魚糜中亞硝酸鹽的含量，mg/g；W1為發酵后魚糜中亞硝酸鹽的含量，mg/g。

正交試驗[20]：在單因素試驗的基礎上，以亞硝酸鹽降解率為評價指標，采用L9（34）正交試驗設計考察發酵溫度（A）、發酵時間（B）、發酵劑接種量（C）對菌株R6降解魚糜中亞硝酸鹽含量的影響，使用Minitab15軟件進行分析，試驗因素與水平見表1。

表1 發酵魚糜工藝條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for process conditions optimization of fermented surimi

1.3.9 感官評價

根據食品感官評價的要求，選取培訓過食品感官檢驗相關知識的專業參評人員10名，對發酵魚糜制品進行品嘗評價，滿分100分。感官評價標準見表2[21]。

表2 發酵魚糜的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented surimi

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離篩選

2.1.1 乳酸菌的分離

從MRS固體培養基上挑取10株有透明圈、乳白色或淡黃色、表面光滑、邊緣較整齊，扁平的單菌落進行革蘭氏染色試驗和過氧化氫酶試驗[22]，從中共篩選出3株革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、無芽孢的菌株，分別標記為R2、R4和R6。

2.1.2 生理生化試驗

對分離菌株進行生理生化試驗，結果見表3。

表3 菌株的生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical experiments results of strains

由表3可知，菌株R2、R4、R6都可以利用葡萄糖產酸但不產氣，均不能使明膠液化、不產硫化氫、不能水解淀粉，吲哚試驗、VP試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性，根據《乳酸細菌分離鑒定及實驗方法》[9]和《伯杰細菌鑒定手冊》[23]初步判定菌株R2、R4、R6均為乳酸菌。

2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及鑒定

2.2.1 高效降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

菌株R2、R4和R6對亞硝酸鹽（50 μg/mL）的降解能力如表4所示。

表4 3株乳酸菌在MRS培養基中的亞硝酸鹽降解率Table 4 Nitrite degradation rates of 3 kinds of lactate acid bacteria in MRS media

由表4可知，乳酸菌R2、R4、R6在含有約50 μg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養基中培養48 h后對亞硝酸鹽的降解率分別為40.18%、60.29%、96.40%，其中乳酸菌R4及R6對亞硝酸鹽的降解率較高。為進一步考察乳酸菌R4、R6的亞硝酸鹽降解能力，將MRS液體培養基中亞硝酸鹽的含量提高至100 μg/mL[24]，測定發酵液中亞硝酸鹽的殘留量，結果見圖1。

圖1 2株乳酸菌在MRS培養基中的亞硝酸鹽降解率Fig. 1 Nitrite degradation rates of 2 kinds of lactate acid bacteria in MRS media

由圖1可知，乳酸菌R6較乳酸菌R4能高效降解亞硝酸鹽，乳酸菌R6發酵48 h時，亞硝酸鹽降解率為95.84%。因此，選擇乳酸菌R6進行進一步研究。

2.2.2 菌株R6的分子生物學鑒定

對菌株R6的16S rDNA PCR擴增產物進行測序，測序結果在NCBI數據庫中通過BLAST進行檢索比對，選取同源性較高的模式菌株構建系統發育樹[25]，結果如圖2所示。

圖2 乳酸菌R6基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of lactate acid bacteria R6 based on 16S rDNA sequences

由圖2可知，菌株R6與羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）聚于一支，親緣關系近，因此，鑒定菌株R6為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）。

2.3 菌株R6生長特性

2.3.1 菌株R6的生長曲線

菌株R6的生長曲線見圖3。由圖3可知，菌株R6的菌體密度隨著培養時間的延長而逐漸增大，在培養4 h之前為遲滯期，培養4 h后開始進入對數生長期，培養8 h后，菌株R6生長進入穩定期，菌體密度值最大，OD600nm值為1.566，是菌體的最佳收獲時期。

圖3 菌株R6的生長曲線Fig. 3 Growth curve of strain R6

2.3.2 培養溫度對菌株R6生長的影響

培養溫度對菌株R6生長的影響，結果見圖4。由圖4可知，菌株R6在培養溫度15～40 ℃范圍內均可生長，當培養溫度為35 ℃時，菌體密度最大，OD600nm值為1.752；當培養溫度為20 ℃時，菌株R6有微弱的生長，OD600nm值為0.629；當培養溫度高于40 ℃之后，菌株R6仍有一定的生長能力，但是生長受到抑制。綜上所述，菌株R6的適宜生長溫度范圍為20～40 ℃，最適生長溫度為35 ℃。

圖4 培養溫度對菌株R6生長的影響Fig. 4 Effect of culture temperature on the growth of strain R6

2.3.3 NaCl含量對菌株R6生長的影響

NaCl含量對菌株R6生長的影響，結果見圖5。由圖5可知，菌株R6適宜生長的NaCl含量為0～15%，當NaCl含量＞20%之后，乳酸菌R6基本無生長跡象。NaCl耐受性高于凌空等[26]的研究結果（NaCl耐受含量＜8%）。

圖5 NaCl含量對菌株R6生長的影響Fig. 5 Effect of NaCl content on the growth of strain R6

2.4 不同發酵條件對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響

2.4.1 發酵溫度對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響

發酵溫度對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響，結果見圖6。由圖6可知，菌株R6在不同發酵溫度條件下對亞硝酸鹽的降解能力不同。當發酵溫度在30～35 ℃范圍內時，菌株R6對亞硝酸鹽降解率為40.30%～57.50%，明顯高于其他溫度時的亞硝酸鹽降解率，這表明發酵溫度是影響菌株R6降解亞硝酸鹽的一個重要因素。同時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解率隨著培養時間的延長而升高，且菌株R6發酵16 h和24 h時，均在35 ℃條件下對亞硝酸鹽的降解率最大，發酵16 h時，亞硝酸鹽降解率為47.00%，發酵24 h時，亞硝酸鹽降解率為57.50%。

圖6 發酵溫度對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響Fig. 6 Effect of fermentation temperature on nitrite degradation of strain R6

2.4.2 初始pH值對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響

初始pH值對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響，結果見圖7。由圖7可知，菌株R6對亞硝酸鹽的降解能力受初始pH值的影響明顯。當初始pH值為5.5時，菌株R6發酵16 h和24 h后，亞硝酸鹽降解率均為最高，發酵16 h后亞硝酸鹽降解率為33.90%，發酵24 h后亞硝酸鹽降解率為60.30%；當初始pH值＜4.5時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解效果不明顯；當初始pH值＞6.0時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解能力減弱。分析原因可能是分離到的菌株R6對亞硝酸鹽的降解可能以亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiRs）降解為主，而酸降解發揮著次要的作用[27]。

圖7 初始pH值對菌株R6降解亞硝酸鹽的影響Fig. 7 Effect of initial pH value on nitrite degradation of strain R6

2.5 發酵魚糜工藝條件優化

2.5.1 發酵溫度對菌株R6降解魚糜中亞硝酸鹽的影響

發酵溫度對菌株R6降解魚糜中亞硝酸鹽降解的影響，結果見圖8。由圖8可知，當發酵溫度為20 ℃時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解率為45.00%；當發酵溫度低于35 ℃時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解率隨發酵溫度的升高而提高；當發酵溫度達到35 ℃時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解能力最強，降解率為49.10%；當發酵溫度高于35 ℃之后，菌株R6對亞硝酸鹽的降解率開始降低。分析原因可能是低溫不利于菌株R6的生長，所以發酵溫度低于25 ℃時，亞硝酸鹽的降解率都不太高，隨著發酵溫度的升高，菌株R6開始大量繁殖，大量產酸，NiRs的活性增強，亞硝酸鹽降解率也開始升高，特別是當發酵溫度上升至35 ℃時，菌株R6對亞硝酸鹽的降解作用最佳，這與王磊等[28]研究的最佳發酵溫度為30 ℃不同。當發酵溫度持續上升至高于35 ℃之后，菌株R6的生長和NiRs的活性又受到溫度的抑制，導致亞硝酸鹽的降解率降低。所以最適發酵溫度為35 ℃。

圖8 不同發酵溫度對發酵魚糜中亞硝酸鹽降解率的影響Fig. 8 Effect of different fermentation temperature on degradation rates of nitrite in fermented surimi

2.5.2 發酵時間對菌株R6降解魚糜中亞硝酸鹽的影響

發酵時間對菌株R6降解魚糜中亞硝酸鹽的影響，結果見圖9。由圖9可知，隨著發酵時間的延長，魚糜中亞硝酸鹽降解率先升高后趨于平緩。當發酵時間為30 h，亞硝酸鹽降解率最高，為49.20%，但發酵時間＞30 h之后，可能導致發酵魚糜的風味口味變差[29]。所以選擇最適發酵時間為30 h。

圖9 不同發酵時間對發酵魚糜中亞硝酸鹽降解率的影響Fig. 9 Effect of different fermentation time on degradation rates of nitrite in fermented surimi

2.5.3 發酵劑接種量對菌株R6降解魚糜中亞硝酸鹽的影響

將菌株R6作為發酵劑接種到魚糜中，研究發酵劑接種量對發酵魚糜中亞硝酸鹽降解率的影響，結果見圖10。由圖10可知，當菌株R6接種量為1.0%時，亞硝酸鹽的降解率最高，為49.13%，繼續增加菌株R6的接種量，亞硝酸鹽降解率也沒有明顯升高。因此，選擇發酵劑最適接種量為1.0%。

圖10 不同接種量對發酵魚糜中亞硝酸鹽降解率的影響Fig. 10 Effect of different inoculum on degradation rates of nitrite in fermented surimi

2.5.4 發酵魚糜工藝條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）、發酵劑接種量（C）3個因素為考察因素，亞硝酸鹽降解率為考察指標，進行3因素3水平的正交試驗，以確定最優的工藝參數[30]。正交試驗結果與分析見表5，方差分析見表6。

表5 發酵魚糜工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for process condition optimization of fermented surimi

由表5可知，發酵溫度、發酵時間、發酵劑接種量的極值R分別為10.00、6.22、13.11，因此，各個因素對試驗結果的影響主次順序為C＞A＞B，即發酵劑接種量＞發酵溫度＞發酵時間。發酵魚糜最佳工藝條件組合為A1B3C2，即發酵溫度30 ℃、發酵時間30 h、菌株R6接種量1.0%。

表6 正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表6可知，發酵溫度、發酵時間、發酵劑接種量這3個因素對亞硝酸鹽降解率均無顯著性影響（P＞0.05），且發酵時間對試驗結果影響最小。

2.5.5 最優工藝條件驗證

采用最優發酵條件制備魚糜，發酵魚糜中亞硝酸鹽殘留量為0.52 mg/kg，降解率為65.33%，感官評分為87.3分，與正交試驗結果一致。而未添加乳酸菌的空白對照的魚糜中亞硝酸鹽殘留量為1.13 mg/kg，降解率為24.26%，感官評分為73.7分。說明腌制魚糜中加入乳酸菌作發酵劑，不僅可以降低亞硝酸鹽含量，同時能夠改善魚糜制品的感官品質，得到風味和品質俱佳的魚糜制品。

3 結論

從傳統腌制巴浪魚干中篩選出3株乳酸菌，其中乳酸菌R6亞硝酸鹽降解能力最強，培養48 h后，亞硝酸鹽降解率為96.40%，經分子生物學鑒定為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）。菌株R6的最適生長溫度為35 ℃，可耐受20%NaCl；降解亞硝酸鹽的最適溫度為35 ℃，最適初始pH值為5.5。乳酸菌R6發酵魚糜的最優工藝條件為菌株R6接種量1.0%、發酵溫度30 ℃、發酵時間為30 h，在此最優條件下，菌株R6發酵后的魚糜中亞硝酸鹽含量由1.50 mg/kg降低至0.52 mg/kg，降解率為65.33%，感官評分為87.3分。