響應面法優化駝乳乳清蛋白酶解制備抑菌肽工藝參數

王瑞雪，吉日木圖，2，3，伊 麗*

（1.內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010018；2.內蒙古駱駝保護學會，內蒙古 呼和浩特010018；3.內蒙古駱駝研究院，內蒙古 阿拉善737300）

抗菌肽也稱為肽類抗生素，是由生物體產生的具有抗菌活性的小分子蛋白質，并且是宿主先天性非特異性防御系統的重要組成部分。抗菌肽的氨基酸數目通常＜100，帶有正電荷，具有殺傷細菌、真菌、原生動物，抑制病毒繁殖，特異性抑制某些腫瘤細胞生長的作用，且對艾滋病也有一定的抑制作用[1-2]。抗菌肽的發現為醫藥用途提供了新的希望。目前，對于乳源性抗菌肽的研究主要集中在乳鐵蛋白抗菌肽，少數幾種乳酪蛋白源抗菌肽以及從干酪或酸乳等乳制品中分離得到的抗菌肽。這些乳源性抗菌肽都對G+和G-菌具有強烈的抑制作用[3]。乳源性抗菌肽的發現改變過去對單一的乳蛋白營養功能評價，具有良好的應用前景。

駝乳蛋白是生物活性肽的豐富來源。駝乳蛋白主要分為乳清蛋白和酪蛋白。其中，駝乳乳清蛋白占總蛋白的30%左右，并富含如乳鐵蛋白，乳過氧化物酶，脂肪球膜蛋白，溶菌酶和免疫球蛋白等保護性蛋白[3]。研究表明，駱駝乳乳清蛋白酶解物具有抗腫瘤[4]、抗糖尿病[5]、抗感染性[6]、抗氧化[7]、抗炎抗菌[8]、降血壓[9]、提高免疫力[10]等作用。目前，國內對駝乳營養成分，理化特性及其生物學特性的研究較多，但對駝乳乳清蛋白酶解的研究較少。且已發表的駝乳蛋白源生物活性肽的研究主要集中在降血壓肽和抗氧化活性肽上，而對于其抗菌功能肽的研究尚未報道。由于在酶解過程中不同蛋白酶的作用位點不同，導致蛋白的水解程度有所差異，所得酶解產物的氨基酸含量和功能特征也有所差別，因此有必要篩選水解程度和抑菌條件最佳的蛋白酶，并確定其酶解規律及最適酶解條件。

本試驗選用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對駝乳乳清蛋白進行酶解，以水解度（degree of hydrolysis，DH）為評價標準，以抑菌率為抑菌效果評價指標。根據單因素結果，篩選出較為合適的酶，通過響應面法優化其酶解條件，初步確定制備駝乳乳清蛋白抗菌肽的最佳工藝參數，為進一步研究駝乳乳清蛋白抗菌肽的功能特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳乳清蛋白：采集內蒙古阿拉善新鮮駱駝乳，后經實驗室提取獲得乳清蛋白。

胃蛋白酶（10 000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（6 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；大腸桿菌（E.coli）ATCC 25922、LB液體培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；NaCl、HCl、NaOH等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SQ510C高壓滅菌鍋：重慶雅馬科技有限公司；GHP-9270恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；JC-HH-S24恒溫水浴鍋：濟南精誠實驗儀器有限公司；5811FN279354冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；PB-10PH計：賽多利科學儀器（北京）有限公司；SynergyH1酶標儀：雷康恒泰（北京）商貿有限公司；SW-CJ-FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳清蛋白的制備

取出儲存在-20 ℃的駝乳樣品300 mL，做3組平行試驗，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄去上層脂肪，制得脫脂乳。將獲得的脫脂乳于45 ℃水浴鍋中加熱30 min。根據等電點法，用1 mol/L HCl調脫脂乳pH至4.4，調節pH過程中不斷攪拌，4 ℃、8 000 r/min離心20 min。收集離心后的上清液，即為等電點（pH4.4）沉淀酪蛋白后的乳清蛋白樣品。將得到的乳清蛋白于-80 ℃冰箱預凍24 h后，放入冷凍干燥機中，在-50 ℃、2～10 Pa條件下真空冷凍干燥，得到駝乳乳清蛋白凍干粉。

1.3.2 駝乳清蛋白的酶法水解

乳清蛋白粉→加蒸餾水溶解→調節pH（4.4）→設定水浴溫度→加蛋白酶水解→滅酶（100 ℃、10 min）→離心（4 ℃、8 000 r/min、30 min）→水解液→凍干

1.3.3 水解度的測定

本試驗將采用鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）法[11-12]測定水解度，計算公式為：

其中：h為水解過程中，每克蛋白被斷裂的肽鍵數，mmol/g；htot為每克蛋白質所含的總肽鍵數，通常地，乳清蛋白質的htot為8.8 mmol/g蛋白。

1.3.4 抑菌率的測定

參考鄭健[13]的方法，采用試管法檢測抗菌活性。首先進行菌種活化，在無菌操作下，將保存的大腸桿菌E.coli（ATCC 25922）接種于已經配制好的LB液體培養基中培養，在37 ℃培養箱中培養18～24 h，傳3代后4 ℃備用；采用平板菌落計數法計算出原菌液的菌體濃度（CFU）并測定相應的吸光度值OD600nm值；根據測定的菌懸液OD600nm值，用85%的無菌生理鹽水稀釋該菌懸液，使其最終的菌數調到106CFU/mL。

在8 mL滅菌LB液體培養基中加入1 mL菌懸液，再加入1 mL樣品溶液，混勻后，在37 ℃條件下培養并且每相隔4 h取出一次測定OD600nm值，以加無菌水為空白，以未經過酶解處理的乳清蛋白為對照，根據下列公式計算抗菌活性。×100%（OD值為3次平行實驗平均值）

1.3.5 DPPH自由基的清除能力

參考BOUGATEF A等[14]的方法，稱取19.7 mg DPPH溶解于無水乙醇中，在避光條件下定容于250 mL棕色容量瓶中，搖勻，配制成濃度為2×10-4mol/L的溶液，保存于冰箱中。準確將2 mL DPPH·溶液和2 mL酶解液到15 mL試管中，混合并振蕩均勻，避光靜置30 min后，取三組平行樣在波長517 nm處測定樣品的吸光度值Ai，使用等體積的無水乙醇溶液代替DPPH·無水乙醇溶液作為空白組，使用等體積蒸餾水代替酶解液作為對照組，在波長517 nm處分別測定其吸光度值。

DPPH自由基清除率的計算公式如下：

DPPH自由基清除率

式中：Ai為樣品組吸光度值；Aj為空白組吸光度值；A0為對照組吸光度值。

1.3.6 單因素試驗設計

每種蛋白酶一共設定5個影響因素，5個水平試驗，固定其中4個因素改變1個因素，以水解度為評價指標[15-17]。胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解條件的優化試驗設計見表1。

表1 不同蛋白酶的作用條件優化單因素試驗Table 1 Single factor experiments for working conditions optimization of different proteases

1.3.7 獲得抗菌肽最佳蛋白酶的選擇

通過單因素確定胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶4種蛋白酶的最佳水解條件。以抑制率為評價指標，篩選出酶解駝乳清蛋白制備抗菌肽的最佳蛋白酶。同時，以DPPH自由基的清除率為評價指標，測定各蛋白酶酶解液的抗氧化能力。

1.3.8 制備抗菌肽酶解單因素試驗

利用篩選出的蛋白酶酶解駝乳乳清蛋白，分別考察溫度、時間、pH、底物濃度和酶濃度對抑菌率的影響，確定了最佳的蛋白酶酶解物的抑菌率單因素水平。

1.3.9 響應面試驗

根據單因素試驗結果，用Box-Behnken中心組合設計原理，選擇對駝乳乳清蛋白水解物的抑菌率影響較大的3個因素：pH值、溫度、時間為自變量，以抑菌率為響應值進行響應面設計，采用Design-Expert 8.05b軟件進行響應面試驗。試驗因素與水平設計見表2。

表2 胃蛋白酶酶解條件優化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for pepsin hydrolysis conditions optimization

2 結果與分析

2.1 各蛋白酶單因素試驗結果

2.1.1 不同酶解溫度對駝乳乳清蛋白水解度的影響

圖1 不同酶解溫度對駝乳乳清蛋白水解度的影響Fig. 1 Effect of different hydrolysis temperature on hydrolysis degree of camel whey protein

由圖1可知，4種蛋白酶的水解度均隨著酶解溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，胃蛋白酶的水解度在40 ℃時達到最大值，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度在45 ℃時達到最大值，而堿性蛋白酶的水解度則在50 ℃時達到最大。其原因是由于在一定的溫度范圍內，溫度升高反應物分子獲得能量，反應速率加快，從而使水解度增大，但溫度過高會導致蛋白酶變性失活，從而使反應速率下降，水解度降低[18]。木瓜蛋白酶在45 ℃和50 ℃時的水解度沒有顯著性差異（P＜0.05），考慮到酶解溫度越高酶的活性越不穩定，因此胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的較適酶解溫度分別為40 ℃、45 ℃、45 ℃和50 ℃。

2.1.2 不同酶解pH值對駝乳乳清蛋白水解度的影響

酶解pH值過低或者過高都會使酶失活從而影響酶的作用效果。在最佳pH條件下，酶保持其最優的空間結構，酶活性中心與底物的結合最好，因此，在最適pH條件下，酶具有最佳的催化活性。由圖2可知，不同的蛋白酶對酸堿環境的要求不同，胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶分別在pH=2、pH=6、pH=8.5和pH=9.5時水解度達到最大值。

圖2 不同酶解pH值對駝乳乳清蛋白水解度的影響Fig. 2 Effect of different hydrolysis pH on hydrolysis degree of camel whey protein

2.1.3 不同酶解時間對駝乳乳清蛋白水解度的影響

圖3 不同酶解時間對駝乳乳清蛋白水解度的影響Fig. 3 Effect of different hydrolysis time on hydrolysis degree of camel whey protein

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度呈先上升后趨于平緩的下降趨勢。對于木瓜蛋白酶來說在4 h時與乳清蛋白完全作用，之后隨反應時間的延長水解度呈下降趨勢；而對于其他蛋白酶來說，水解度則在6 h時基本與蛋白質完全作用，而后水解度的變化趨于緩慢。這是由于隨著水解的進行，水解的底物濃度逐漸減小，蛋白酶的特異性催化位點減少，蛋白酶在水解過程中逐漸失活[19]，因此時間過短會導致水解不徹底，蛋白酶的作用發揮不完全；水解時間過長，會導致酶喪失活性，產生的多肽過會抑制蛋白酶水解。綜合考慮，確定胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶的最佳水解時間為6 h，木瓜蛋白酶的最佳水解時間為4 h。

2.1.4 不同底物濃度對駝乳乳清蛋白水解度的影響

圖4 不同底物濃度對駝乳乳清蛋白水解度的影響Fig. 4 Effect of different substrate concentration on hydrolysis degree of camel whey protein

由圖4可知，底物濃度對水解度的影響與溫度相同，即隨著底物濃度的增加，水解度呈先增大后減小的趨勢。這是由于當底物濃度較低時，酶與底物結合的概率較小，因此水解度較低，所以增加底物的量會使水解度增大；當底物濃度過高時，與底物結合的蛋白酶的量有限，導致水解不徹底，且蛋白質溶液的黏度增大，影響蛋白酶的擴散，從而對水解反應有抑制作用。因此最終選擇各酶的底物濃度為3%。

2.1.5 酶與底物比對駝乳乳清蛋白水解度的影響

圖5 不同酶與底物比對駝乳乳清蛋白水解度的影響Fig. 5 Effect of different enzyme and substrate concentration rate on hydrolysis degree of camel whey protein

由圖5可知，隨著酶添加量的增多，在一定范圍內水解度呈上升趨勢，當胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶與底物濃度比超過1∶50時，水解度的變化不顯著（P＞0.05），只有堿性蛋白酶在酶與底物濃度比超過1∶50時水解度有下降趨勢。這是由于當酶的添加量較低時，酶與底物作用小，不能完全水解蛋白質，但考慮到經濟因素酶的添加量不宜過多，因此選用1∶50為4種酶的最佳酶與底物比。

2.2 蛋白酶水解物的抑菌效果

各蛋白酶水解物的抑菌效果與DPPH·清除率的結果見表3。由表3可知，各蛋白酶對駝乳乳清蛋白抑菌效果的影響順序為胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶。這是由于不同蛋白酶水解的作用效果不同，酶切位點不同，從而產生的功能性肽就不同。胃蛋白酶水解物的抑菌率為82.12%，且有一定的抗氧化活性（DPPH·清除率為49.17%）。木瓜蛋白酶的水解產物的抗菌活性較低僅為10%，堿性蛋白酶不會水解出具有抗菌活性的肽段，而其酶解液卻具有抗氧化活性。由于本實驗的目的是篩選抗菌肽，因此選用胃蛋白酶進行單因素和響應面試驗。

表3 蛋白酶水解物的抑菌率結果Table 3 Antibacterial rate results of hydrolysis products prepared with different proteases

2.3 胃蛋白酶抑菌實驗結果

2.3.1 不同溫度對駝乳乳清蛋白酶解液抑菌率的影響

圖6 不同溫度對酶解液抑菌率的影響Fig. 6 Effect of different temperature on hydrolysis degree and antibacterial rate of hydrolysate

從圖6可知，當溫度從37 ℃升至40 ℃時，駝乳乳清蛋白的水解度與其酶解液的抑菌率隨溫度的升高而增加，40 ℃時水解度最大，抗菌活性最強。之后隨溫度的升高水解度和抑菌率均呈下降趨勢，至55 ℃時抑菌率較低，僅為58.33%。這可能是由于在一定溫度范圍內，溫度升高有利于酶解的進行，但過高的溫度會導致酶變性，使其活性減弱，從而導致水解速率降低，釋放的抑菌物質減少，故此最佳抑菌溫度為40 ℃。

圖7 不同pH值對酶解液抑菌率的影響Fig. 7 Effect of different pH value on hydrolysis degree and antibacterial rate of hydrolysate

2.3.2 pH對駝乳乳清蛋白酶解液抑菌率的影響從圖7可知，駝乳乳清蛋白水解度和乳清蛋白酶解液的抗菌活性均隨著pH值的升高呈先增加后降低的趨勢。當pH值為2.0時水解度和抑菌率均達到最高，分別為8.21%和84.96%，之后呈下降趨勢。這是由于pH繼續升高，會使酶的活性降低，乳清蛋白中的大分子物質未被水解，也會導致獲得的乳清蛋白肽的量減少[20]，因此最佳的pH為2.0。

2.3.3 不同水解時間對駝乳乳清蛋白酶解液抑菌率的影響

從圖8可知，隨著酶解時間的延長，水解度與抑菌率均呈先上升后下降的趨勢。當酶解時間為4 h時，水解產物的水解度達到最大值，抑菌活性最強（82.69%）。隨著水解時間的延長，抗菌活性逐漸減弱，可能是由于水解初期，通過胃蛋白酶的作用獲得的肽鍵數目較多，而隨著反應時間的延長肽鍵被酶解作用斷開，水解產物中的游離氨基酸相對含量增加，可能會使產生的抗菌肽被進一步水解，從而破壞其原本具有抗菌活性肽段結構上的完整性[21-22]。因此最佳的水解時間為4 h。

圖8 不同水解時間對水解度及酶解液抑菌率的影響Fig. 8 Effect of different hydrolysis time on hydrolysis degree and antibacterial rate of hydrolysate

2.3.4 不同底物濃度對駝乳乳清蛋白酶解液抑菌率的影響

由圖4可知，當底物濃度為3%時乳清蛋白的水解度達到最大，表明此時酶活性最強；從圖9可知，當底物濃度為4%時，得到的酶水解產物的抗菌活性最強（87.25%），表明此時水解得到的抗菌活性物質較多。故最佳抑菌底物濃度為4%。

圖9 不同底物濃度對酶解液抑菌率的影響Fig. 9 Effect of different substrate concentration on hydrolysis degree and antibacterial rate of hydrolysate

2.3.5 酶與底物比對駝乳乳清蛋白酶解液抑菌率的影響

從圖10可知，當酶與底物比為1∶50時水解度達到最大值，但酶解產物的抗菌活性則是在酶與底物比為1∶100時最高，隨著酶與底物比再增加，抗菌活性逐漸降低。這可能是因為在酶濃度較低時，酶分子所能結合的底物較少，而過量的蛋白酶使一部分具有抗菌活性的肽段被再次分解為活性更小的肽或者氨基酸，從而降低抑菌活性[21]。所以最佳的酶與底物比為1∶100。

圖10 不同酶與底物比對酶解液抑菌率的影響Fig. 10 Effects of different enzyme and substrate concentration rate on hydrolysis degree and antibacterial rate of hydrolysate

通過以上單因素試驗結果可以得出胃蛋白酶水解駝乳乳清蛋白的最佳條件為酶解溫度為40 ℃、酶解pH為2.00、酶解時間為4 h，酶解底物濃度為4%，酶與底物濃度比為1∶100。根據單因素結果進行正交試驗選出影響較大的因素進行響應面試驗確定最終的水解條件。

2.4 響應面試驗設計結果

根據單因素試驗結果，選擇對駝乳乳清蛋白水解度影響較大的3個因素：pH值（A）、溫度（B）、時間（C）為評價因素，以抑菌率（Y）為評價指標，采用Design-Expert 8.05b軟件進行響應面試驗。試驗的因素水平如表4所示。

表4 胃蛋白酶酶解條件優化響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface experiments for pepsin hydrolysis conditions optimization

通過統計分析軟件Design-Expert 8.05b進行數據分析，建立二次響應面模型為：Y=3.16+9.896 25A+3.0465B+0.89188C-0.61AB+0.0325AC+0.06125BC-0.3325A2-0.0358B2-0.321 88C2。回歸分析與方差分析結果及交互作用的響應面分析，結果見表5和圖11。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

由表5可知，該模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著，且該模型R2=97.58%，R2Adj=94.46%，說明該模型與實驗擬合良好，可用于該反應的理論推測。由表5的F值大小可以得到影響抑菌率的各因素主次順序為pH（A）＞時間（C）＞溫度（B），其中一次項因素中A、C對抑菌率影響極顯著（P＜0.01），B對抑菌率影響顯著（P＜0.05），交互項中AB和BC對抑菌率影響顯著（P＜0.05），平方項中B2和C2對抑菌率的影響均為極顯著（P＜0.01）。在此基礎上優化胃蛋白酶最佳酶解條件參數為：酶解溫度為40 ℃、酶解pH為3.00、酶解時間為5.3 h，抑菌率為83.64%，在此條件下進行酶解，抑菌率為83.91%。試驗模型與實際數據擬合良好，試驗誤差小僅為0.27%，建立的模型可以對實際工藝進行預測。

圖11 各因素交互作用對抑菌率的影響的響應面圖及等高線Fig. 11 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on antibacterial rate

3 結論

本試驗以水解度為指標，確定了胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶4種蛋白酶的酶解最佳條件；以大腸桿菌E.coli（ATCC 25922）的抑菌率為指標確定了胃蛋白酶為駝乳乳清蛋白抗菌肽制備酶，并通過單因素試驗和響應面法獲得了胃蛋白酶最佳酶解條件參數：酶解溫度為40 ℃、酶解pH為3.00、酶解時間為5.3 h，酶解底物濃度為4%，酶與底物濃度比為1∶100，此條件下抗菌肽的抑菌率為83.91%。本試驗為駝乳蛋白源抗菌肽的制備提供了工藝參數，為駝乳蛋白附加值的提升提供了新思路，更是為駝乳產業的多元化發展奠定了理論基礎。至于駝乳蛋白源抗菌肽的結構及其對其他致病菌的抑制性有待今后進一步研究。