釀酒酵母GY-1的固定化及其對魔芋寡糖中單糖的利用

唐湘華，楊云娟，李俊俊，韓楠玉，慕躍林，吳 倩，黃遵錫*

（1.云南師范大學 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南 昆明650500；2.云南省酶工程技術研究中心，云南 昆明650500）

固定化技術是現代工業上廣泛使用的一類新型生物技術[1-2]，酵母的固定化研究利用物理、化學等方法將酵母細胞約束或者限制在一定的空間內，使細胞仍能保留其催化活性，并且具有能被反復利用的活力。釀酒酵母固定化細胞具有代謝快、反應快、抗污染能力強，能夠連續使用，有利于產物分離的特點，并且逐漸已被廣泛的應用于食品與發酵工業中[3-6]。常用的固定化包埋劑采用海藻酸鈉、卡拉膠、羥甲基纖維素鈉等多糖膠[7-9]。魔芋膠[10-11]是一種黏度較高的新型多糖膠，魔芋粉溶解形成的膠狀多糖細膩，和海藻酸鈉組合具有一定的柔軟性和圓滑性，顆粒疏松多孔，便于酵母呼吸作用，能通過縫隙利用游離的單糖作能源維持生命活動。

魔芋中含有大量的魔芋多糖，為天然高分子化合物，具有較好的黏性，能與水結合成膠體溶液，可用于食品穩定劑[11-14]、增稠劑[15]、膠凝劑[16]、石油萃取黏膠劑[17-18]。魔芋中的多糖主要為葡甘露聚糖，其水解產物魔芋寡糖，現已逐步被用于改善人體腸道內環境，通過調節腸道微生物菌群來治療當前大量的慢性疾病[19-21]，解決腸道微生物菌群失調間接與其他疾病相關的問題[22-25]。魔芋粉水解產物中會有還原性單糖[26]的存在，降低寡糖的純度和使用效果，不利于市場的開發。

本實驗采用海藻酸鈉和魔芋粉組合固化交聯劑，包埋高濃度的釀酒酵母，通過三級反應柱對酶法水解的魔芋粉水解產物進行單糖去除實驗，采用生物降解法快速、高效降解，避免較多副產物的生成和縮短樣品處理周期。實驗分析了固定化酵母細胞的活性能力；采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法測試了固定化酵母對魔芋粉水解產物中單糖的去除，為后續低聚糖混合物的分離、純化提供可行性技術路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GY-1：云南師范大學生科學院微生物實驗室通過離心噴霧干燥設備制備。

β-甘露聚糖酶（10 000 U/g）：昆明愛科特生物科技有限公司；海藻酸鈉（分析純）：上海潤捷化學試劑有限公司；魔芋精粉（食品級）：麗江玉元食品有限公司；CaCl（2分析純）：成都臨江化工廠；葡萄糖（分析純），3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團化學試劑有限公司；甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露六糖（純度均為≥95%）：南京草本源生物科技有限公司；魔芋膠（含有2%～3%的還原糖）：實驗室通過β-甘露聚酶水解20%濃度的魔芋粉制備形成的低聚糖水解液。

1.2 儀器與設備

CJJ-931四聯磁力加熱攪拌器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；CX22LEDRFSI奧林巴斯顯微鏡：日本OLYMPUS公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；CP1502電子稱：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TGL-16B高速離心機：上海安亭科學儀器廠；NDJ-1旋轉黏度計：上海群昶科學儀器有限公司；多級離子交換柱1.8 cm×35 cm×3根（每根裝液體積為32.0 mL）：上海方畦儀器有限公司；S100-11B+TH1013型微量泵：保定迪創電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酵母GY-1的制備

取100 mL的40 ℃水溶解酵母，在磁力攪拌器上混合攪拌30 min，再稱取1%的海藻酸鈉和相應比例的魔芋粉（各組合比例見表1），混合，加入混有酵母粉水溶液中，攪拌混合1 h，使用微量泵滴到4%CaCl2溶液中，在低溫條件下交聯反應10 h，觀察固定化酵母顆粒硬度、形狀、大小、顆粒光滑程度。

表1 固定化酵母GY-1的海藻酸鈉、魔芋粉及酵母配比Table 1 Ratio of sodium alginate, konjac powder and yeast for immobilized yeast GY-1

1.3.2 分析檢測

（1）還原糖含量的測定

取魔芋粉水解產物進行適當稀釋，取3支試管，兩支試管中每支試管裝入0.2 mL稀釋液，一支試管裝入0.2 mL蒸餾水，每支試管加入3 mL DNS試劑，沸水浴條件下煮沸5 min，冷卻，補水使反應體積總體積為15 mL，在波長540 nm條件下測定吸光度值，計算酶解液中還原糖的含量。

（2）糖度的測定

糖度測定是一種快速的方法，可通過在線測定，比還原糖測定快捷，實驗中采用糖度計對寡糖溶液進行監控，為工業化生產檢測提供快捷思路，簡化生產環節。以水為空白校正調零，取水解液放在糖度計測得。

（3）魔芋膠黏度的測定

分別取0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g魔芋精粉加入100 mL的60 ℃熱水中，混合均勻，B型磁力攪拌子在溶液中攪拌4 h，溶液溶脹混合均勻，冷卻至室溫（25 ℃），使用轉子黏度計測定黏度。

（4）固定化酵母死亡率的測定

實驗采用美蘭法測定固定化酵母的死活細胞，將包埋形成的不同濃度的固定化酵母GY-1顆粒用研缽搗碎后，取酵母液0.2 mL放入試管中，加入1.0 mL美蘭試劑，混合均勻，取樣做水封片，在40×高倍鏡下觀察酵母細胞著色情況，如果細胞染成藍色表明是死細胞，計算視野中細胞總數和死細胞個數。

（5）固定化酵母活性的測試

配制3%葡萄糖和0.5%（NH）42SO4的培養基溶液100 mL裝入300 mL的錐形瓶中，共配制13瓶，包扎進行滅菌、冷卻；再分別稱取5.0 g、10.0 g、15.0 g、20.0 g固定化酵母添加到培養液中，每個梯度做3瓶，最后設置一組不添加固定化酵母顆粒作為空白對照互組；實驗樣品全部在30 ℃恒溫靜置培養48 h，分別在6 h、12 h、24 h、48 h取樣測定反應液中的還原糖和稱瓶質量計算二氧化碳的產生量。

1.3.3 柱式反應器流速對固定化酵母利用單糖能力的影響

將三個反應柱串聯固定在鐵架臺上，每個反應柱中裝滿固定化酵母顆粒，進口和出口都置于裝有糖液的燒杯中，利用微量泵對糖液進行循環，當糖液依次經過反應柱時，可利還原單糖滲透進入顆粒中被膠粒中的酵母吸附利用，從而達到降解利用單糖的目的。采用將柱子首尾相連，利用微量泵聯結形成回路，分別在2.5 mL/min、5.0 mL/min和7.5 mL/min的流速條件下，進行固定化酵母利用單糖能力測試，以糖度計快速測定反應柱中的糖度，通過糖度的下降程度反映流速對固定化酵母利用單糖能力的影響，其工藝流程見圖1。

圖1 固定化酵母利用單糖工藝流程Fig. 1 Technological process of monosaccharide utilized by immobilized yeast

1.3.4 不同魔芋膠濃度對固定化酵母利用單糖能力的影響

取魔芋粉制備的高濃度魔芋寡糖溶液配制2%、4%、6%、8%的溶液各500 mL，在30 ℃的水浴鍋中保溫，通過微量泵連接到柱式反應器中進行固定化酵母利用單糖實驗，每隔60 min取100 μL測定還原糖，考察不同的魔芋膠濃度對固定化酵母利用單糖能力的影響。

1.3.5 固定化酵母利用單糖分析

取β-甘露聚糖酶在50 ℃水解10%魔芋50 min，升溫至90 ℃保溫10 min滅酶、過濾、離心，取上清液過0.22 μm濾膜，獲得點樣樣品；取離心的β-甘露聚酶水解液100 mL，溫度保溫控制在30 ℃，過串聯反應柱，通過微量泵控制泵流速為2.5 mL/min，循環反應40 min，取過濾柱Z3的樣品離心，并對離心上清液過0.22 μm濾膜，獲得點樣樣品，按照薄層層析（TLC）法分析產物組成；標準品為甘露糖、甘露二糖和甘露三糖，其他樣品為葡聚糖酶、纖維素酶的水解產物作為對照。

2 結果與分析

2.1 魔芋膠黏度分析

魔芋粉溶解到水中形成高黏度的魔芋膠多糖，流動性較差，具有包埋劑的效果，而且魔芋膠具有潤滑性，制備的顆粒具有一定的硬度和光滑度。實驗分別取0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g魔芋粉加入100 mL熱水中，溶解形成魔芋膠，檢測不同濃度的魔芋膠黏度，結果見圖2。由圖2可知，2%的魔芋膠黏度能達到30 000 mPa·s以上，呈膠狀，無流動性。

圖2 不同魔芋膠粉含量對黏度的影響Fig. 2 Effect of different konjac power concentrations on viscosity

2.2 固定化酵母顆粒物理性能比較

選用海藻酸鈉和魔芋粉作為固化交聯劑，并固定海藻酸鈉的濃度為1%，調整不同濃度魔芋粉的配比分析顆粒的光滑度和硬度，并對包埋酵母的數量進行了檢測，結果見表2。由表2可知，添加10%和15%酵母粉進行固定化制備形成的顆粒硬度較柔軟，不利于使用；而添加1%酵母粉進行固定化制備形成的顆粒硬度合適，但包埋的酵母個數少，也不利于酵母快速利用單糖，縮短生產工藝時間。在對5%酵母粉進行固定化制備形成的顆粒進行分析，表明加入2%的魔芋粉形成的顆粒較好，顆粒均勻，粒度平均直徑為4～5 mm。采用美蘭法測定固定化酵母GY-1的死亡率，1%固定化酵母顆粒中死亡率在17%～20%；10%固定化酵母顆粒中死亡率在15%～29%，而5%固定化酵母死亡率在9%～11%。根據酵母顆粒硬度、光滑程度和酵母細胞的死亡率，綜合考慮選用5%的酵母+1%海藻酸鈉+2%魔芋粉作為固定化顆粒配比組合來制備固定化酵母GY-1。

表2 固定化酵母GY-1顆粒物理形態分析Table 2 Physical morphology analysis of immobilized yeast GY-1 particles

續表

2.4 固定化酵母GY-1利用還原單糖能力測定

通過添加固定化酵母顆粒到3%的葡萄糖溶液中進行靜置培養，分析固定化酵母利用還原單糖的能力測試，培養時間為48 h，結果見圖3。由圖3A可知，培養前后還原糖含量差異較大，48 h后固定化酵母添加量為20%的反應瓶中，還原糖含量由30 mg/mL下降至10 mg/mL左右，還原糖利用率為66%；由圖3B可知，隨著培養時間的延長，二氧化碳產生量在穩定增加，表明固定化酵母的降解能力沒有因為包埋而喪失。

圖3 固定化酵母GY-1對還原單糖的利用能力Fig. 3 Utilization capacity of immobilized yeast GY-1 on reducing monosaccharides

2.5 流速對固定化酵母GY-1利用單糖的影響

為縮短固定化酵母利用單糖的周期，實驗采用動態法進行降解，采用三級柱式反應器進行研究酵母對單糖的分解能力。選用反應體系總體積100 mL魔芋寡糖離心溶液，糖度為12.3°Bx，分別通過Z1柱、Z2柱和Z3柱，通過微量蠕動泵采用2.5 mL/min、5.0 mL/min和7.5 mL/min 的流量進入反應柱，單個整個循環時間為分別為40 min、20 min、13.8 min。由圖4可知，采用蠕動泵進行動態循環，糖液的流速越快，酵母和物料接觸時間短，導致柱中的還原糖分解緩慢，相應的柱Z1、柱Z2和柱Z3的糖濃度具有較大差異，柱Z1、柱Z2和柱Z3的溶液中還原糖逐漸降低。研究發現，寡糖溶液的流量對酵母利用有影響。由圖4a可知，流量為2.5 mL/min時，經過40 min的平衡和固定化酵母的吸附、利用，糖的濃度曲線趨于平衡，平緩降解，糖度為10°Bx；由圖4b可知，流速為5 mL/min時，相應的寡糖濃度變為11.3 °Bx；由圖4c可知，流速為7.5 mL/min時，相應的寡糖濃度變為11.3 °Bx。所以，過反應柱的流量大，循環時間短，有利于還原糖的輕度降解。由圖4d可知，單位時間柱式反應器降解還原糖的效率分析可以看出，采用低流量水解效率要高于高流量水解效率。因此，實驗選擇2.5 mL/min流速用于反應柱去除單糖的研究參數。

圖4 流速對固定化酵母降解還原糖能力的影響Fig. 4 Effect of flow rate on reducing sugars degradation of immobilized yeast

2.6 魔芋寡糖濃度對固定化酵母利用單糖能力的分析

由圖5可知，2%、4%、6%、8%濃度的寡糖液中，還原糖含量隨著柱式反應器中酵母的利用程度呈下降趨勢，形成的曲線呈線性關系。通過對每個濃度的降解曲線進行線性擬合，得方程關系見表4。由表4可知，斜率Ka＞Kb＞Kc≈Kd可以看出采用固定化酵母利用還原糖，其降解能力平緩溫和，低濃度的寡糖降解效率稍高于高濃度，但隨著濃度的增加，降解的效率是趨于一致的，而且由曲線呈線性關系可知該固定化酵母水解溫和，可根據曲線控制酵母的生物轉化時間。由于采用5%的酵母制作的固定化顆粒，酵母濃度較高，但由于酵母細胞處于包埋狀態，沒有過快的增殖效應，水解平緩，降解的還原糖趨勢是穩定的，其降解曲線呈線性關系。濃度越高，單糖利用效率越趨近。因此，完全可在高濃度的寡糖溶液直接添加固定化處理，有利于生產成本的降低。

圖5 固定化酵母對還原糖降解的曲線方程Fig. 5 Degradation curve of reducing sugar by immobilized yeast

表4 固定化酵母對還原糖降解曲線Table 4 Degradation curve equations of reducing sugar by immobilized yeast

為了縮短固定化酵母利用魔芋寡糖溶液中的單糖時間，實驗分析了6 h的酵母利用單糖的能力，結果見圖6。

圖6 還原糖降解率的變化趨勢Fig. 6 Changing trend of degradation rate of reducing sugars

由圖6可知，6 h后在2%、4%、6%、8%的寡糖溶液中還原糖含量分別下降了（42.77±1.70）%、（39.53±1.69）%、（38.83±1.73）%、（38.03±1.68）%，表明通過串聯柱式反應器能在短時間內有效降解魔芋寡糖中的單糖，避免其他副產物的產生，縮短了產品生產周期。

2.7 魔芋寡糖產物的分析

根據β-1,4糖苷鍵的水解特性，選擇纖維素酶、β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶進行了水解魔芋粉，對比水解產物中還原單糖的濃度。由圖7可知，選用的纖維素酶、β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶水解的產物中都存在單糖；酵母固定化采用高密度酵母進行酵解，設計時間短，無酒精等副產物產生，但有少量有機酸產物，后期通過膜處理，保證了產品的純度和品質。甬道11、12為甘露聚糖酶水解產物通過固定化酵母處理，單糖被充分利用消耗掉，沒有出現單糖的斑點，表明單糖已經被酵母利用，選用固定化酵母處理的工藝是可行的。

圖7 魔芋寡糖水解產物的TLC分析結果Fig. 7 TLC analysis results of konjac oligosaccharides

3 結論

本研究針對魔芋粉水解產物中伴隨著還原單糖的出現，采用固定化的釀酒酵母進行生物法去除單糖，同時利用固定化大顆粒特性進行產物分離，采用魔芋粉、海藻酸鈉和酵母粉劑按照一定比例混合制備固定化酵母。實驗分析了固定顆粒的硬度、光滑程度、包埋的酵母數量、死亡率、酵母利用單糖活力測定和固定化酵母在三級反應柱內受泵流量影響還原糖降解的差異分析。實驗結果表明，2%的魔芋粉+1%海藻酸鈉+5%酵母粉組合形成的固定化酵母顆粒均勻，直徑為4～5 mm，包埋的酵母死亡率低于10%；在充滿固定化酵母顆粒的反應柱中，通過動態法去除寡糖中的還原性單糖，選用低速流量為2.5 mL/min對100 mL魔芋水解液中的單糖和固定化酵母循環接觸，加大接觸面積，40 min后溶液中的糖度由12°Bx下降至10°Bx；對酵母處理的水解液通過薄層層析（TLC）法檢測，以沒有酵母利用的樣品為對照進行比較，發現固定化酵母GY-1能夠利用單糖（葡萄糖、甘露糖），對二糖以上聚合體不能利用，可達到純化魔芋寡糖的目的，表明該工藝技術路線是可行的。根據該技術路線進行放大工藝，完全可以用于其他種類單糖去除工藝，對產品的純化、簡化工藝路線具有一定的指導意義。