短鏈脂肪酸對C2C12小鼠骨骼肌細胞AMPK的作用研究

呂曉婷，洪宇桁，牛文彥

（1.天津醫科大學免疫學系，天津300070；2.天津醫科大學醫學影像學院，天津300203）

糖尿病是因胰島素絕對或相對不足以及靶組織細胞對胰島素敏感性降低引起的代謝綜合征，高血糖為其主要標志[1]。骨骼肌是機體攝取餐后葡萄糖的主要器官，攝取80%餐后升高的血糖，對維持血糖穩態發揮重要作用。運動時骨骼肌收縮，促進葡萄糖攝取，增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，是預防和治療2型糖尿病的有效方式[2]。單磷酸腺苷激活蛋白激酶（Adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是由一個催化亞基（α）和兩個調節亞基（β，γ）組成的異三聚體酶，是細胞能量感受器[3-5]。運動時肌肉收縮消耗能量，激活骨骼肌AMPK，進而調節能量代謝[4]。近年來，腸道菌群在肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等代謝疾病中的作用成為研究熱點，已證實腸道菌群可通過調節機體的能量代謝影響2型糖尿病的發生發展[6]。有報道產丁酸菌對胰島素抵抗具有改善作用，短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是腸道產丁酸菌的代謝終產物，其中乙酸、丙酸和丁酸占95%，短鏈脂肪酸在維持腸道水電解質平衡、調節腸道的菌群平衡、改善腸道功能、抗腫瘤和調控基因等方面發揮重要作用[7]。生理情況下，短鏈脂肪酸經乙狀結腸和直腸吸收，經下腔靜脈到達全身循環，作用于外周組織。短鏈脂肪酸也有改善機體葡萄糖穩態和胰島素敏感性的作用,有助于預防肥胖及相關代謝疾病的發生，但其對骨骼肌糖代謝的作用機制仍需探究[7]。已有文獻支持乙酸鈉（NaAce）、丙酸鈉（NaPro）和丁酸鈉（NaBut）作用于 C2C12小鼠骨骼肌細胞[8]，因此本研究分別應用乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育C2C12小鼠骨骼肌細胞，探討短鏈脂肪酸對C2C12小鼠骨骼肌細胞AMPK的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠骨骼肌細胞株C2C12（美國ATCC公司），DMEM培養基（美國GIBCO公司），MTS試劑盒（美國Promega公司），牛血清白蛋白（中國鼎國生物技術公司），抗磷酸化AMPK抗體（美國CST公司），抗β-actin抗體（中國Absin公司），偶聯HRP的山羊抗兔抗體（美國JacksonImmuno Research公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 C2C12細胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養基接種于板中，在37℃，5%CO2培養箱中培養。待細胞密度到80%時，用10%FBS DMEM高糖培基分別配置1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉，孵育C2C12細胞24 h。

1.2.2MTS實驗 分別用0mmol/L，1mmol/L，2mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育C2C12細胞24h，MTS法檢測細胞生存率。

1.2.3 Western blot 配置RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑Na3VO41mmol/L，NaF0.5mmol/L，PIC1μmol/L和 PMSF 200 μmol/L）。棄去細胞上清液，用冷 1×PBS緩沖液洗兩次，用細頭吸管吸凈，加入RIPA裂解液，置于冰上20 min，并收集。預冷離心機至4℃，13 000 r/min，離心 20 min，取上清。將 5×LSB 緩沖液與上清液按1：4的比例混勻，金屬浴100℃煮10min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉到PVDF膜上，用3%牛血清白蛋白封閉2 h，孵育一抗4℃過夜，二抗使用偶聯辣根過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG孵育2 h，條帶用ECL發光液孵育并用曝光機檢測。β-actin為內參，Image J軟件定量分析。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism6統計軟件進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），實驗數據均以mean±SEM表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對C2C12細胞活力的影響 分別用不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育C2C12細胞24h。如圖1所示，1mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸鈉處理后細胞存活率分別為對照組的100.73%±0.07、98.76%±0.03、101.12%±0.05、107.15%±0.05 和103.11%±0.08倍，與對照組相比均無統計學差異，說明乙酸鈉在濃度為1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8mmol/L和16mmol/L時對C2C12細胞沒有細胞毒性；1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L的丙酸鈉處理后細胞存活率分別為對照組的102.88%±0.03、1 04.13% ±0.02、102.71% ±0.06、99.55% ±0.02 和101.23%±0.02倍，與對照組相比均無統計學差異，說明丙酸鈉在濃度為1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L時對C2C12細胞沒有細胞毒性；1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L的丁酸鈉處理后細胞存活率分別為對照組的104.05% ±0.05、102.18% ±0.02、101.91% ±0.05、106.60%±0.03和95.38%±0.03倍，與對照組相比均無統計學差異，說明丁酸鈉在濃度為1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L時對 C2C12細胞沒有細胞毒性，均可用于后續實驗。

圖1 不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對C2C12細胞生存率的影響Fig 1 Effects of different concentrations of sodium acetate,sodium propionateandsodiumbutyrateontheviabilityofC2C12cells

2.2 乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對AMPK的影響 用不同濃度（0 mmol/L，1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L）的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉分別孵育 C2C12細胞 24 h，Western blot檢測 AMPK磷酸化和總蛋白。以橫坐標為乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的濃度，以縱坐標為pAMPK/β-actin的比值，如圖2所示，與對照組相比，1 mmol/L和4 mmol/L乙酸鈉孵育后，AMPK磷酸化水平分別是對照組的1.34±0.08倍（P<0.01） 和 1.30±0.08 倍（P<0.01），AMPK總蛋白沒有變化；4 mmol/L丙酸鈉孵育后，AMPK磷酸化水平是對照組的1.68±0.30倍（P<0.05），AMPK總蛋白沒有變化；4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L丁酸鈉孵育后，AMPK磷酸化水平分別是對照組的 1.52±0.11 倍（P<0.01）、1.34±0.10 倍（P<0.01）和 1.53±0.20倍（P<0.05），AMPK 總蛋白沒有變化，提示乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉均激活AMPK且不影響AMPK總蛋白。

圖2 C2C12細胞中AMPK pT172的磷酸化水平Fig 2 The phosphrylation of AMPK pT172 in C2C12 cells

3 討論

AMPK是機體維持代謝平衡所需分子，其活化在糖脂代謝方面發揮重要作用[9]。AMPK在真核生物中普遍表達，其α亞基起催化作用，主要代表AMPK的活性，β和γ亞基在維持三聚體穩定性和作用底物特異性方面起重要作用，每個亞單位都存在 2~3 種基因所編碼的異構體（α1，α2、β1，β2、γ1，γ2，γ3）[10]。α 亞單位中的 8 個位點（蘇氨酸 172、蘇氨酸258和絲氨酸485等）均可被磷酸化，其中蘇氨酸172位點的磷酸化對AMPK活性起重要作用，該位點的磷酸化提示AMPK的活化。AMPK活性主要受細胞中AMP/ATP比值的調節，生理情況下，為了維持基本的代謝需要，細胞中維持著高濃度的ATP水平，運動時肌肉收縮，骨骼肌能量消耗增加可達100倍，ATP轉化為 AMP，AMP/ATP比值升高，AMPK被激活，促進葡萄糖轉運[4,11-12]。

腸道菌群寄居于人胃腸道內，它們能抵御感染和降低自體免疫疾病的患病風險，還能影響體重和消化能力[13]。將健康人的腸道微生物群轉移到代謝綜合征患者腸道內可提高代謝綜合征患者的胰島素敏感性[7]。丁酸菌等腸道微生物群發酵食物時由于缺乏合適的酶而不完全水解，產生短鏈脂肪酸，進入體循環直接影響外周組織的代謝和功能[14-15]。在肥胖小鼠中，補充丁酸鹽可增加胰島素敏感性并減輕體質量，可見短鏈脂肪酸在糖尿病等代謝疾病中發揮作用[16]。在肝細胞和脂肪細胞中，乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉通過激活AMPK防止高脂飲食誘導的肥胖[8]。本研究發現，在小鼠骨骼肌細胞中，乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉均激活AMPK，提示短鏈脂肪酸可通過AMPK信號通路促進骨骼肌葡萄糖攝取。有文獻報道，GPR41（G 蛋白偶聯受體 41）和 GPR43（G 蛋白偶聯受體43）是短鏈脂肪酸的受體，分布于骨骼肌和肝臟等器官中，短鏈脂肪酸可能通過GPR41/GPR43介導的機制增加骨骼肌葡萄糖攝取[7]。有研究指出，丁酸改善大鼠骨骼肌線粒體功能，促進PGC-1α（過氧化物酶體增殖物激活受體C輔助激活因子-1α）的表達，在能量代謝中發揮作用[17]，而增加PGC-1α的表達可激活小鼠骨骼肌AMPK，推測丁酸可能通過PGC-1α途徑激活AMPK[17]。

綜上所述，筆者發現短鏈脂肪酸磷酸化小鼠骨骼肌細胞AMPK，有助于進一步研究其改善胰島素抵抗的詳細機制，以及通過調節腸道菌群改善胰島素抵抗。