基于網絡藥理學預測當歸貝母苦參丸治療前列腺癌作用靶點及細胞內信號轉導通路

胡 楊，吳雄志

（天津醫科大學腫瘤醫院中醫科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心,天津300060）

前列腺癌是男性疾病和死亡的主要原因，每年約有160萬男性被診斷出患有前列腺癌[1]。在過去的幾十年中，已經提出了許多針對前列腺癌的治療策略，例如雄激素阻斷治療、手術和放療等[2]。然而，由于傳統療法的不良反應以及高昂的費用使得一部分病人最終不得不中斷治療[3]。中藥復方能夠增加腫瘤患者對化療藥物的敏感性、減少常規化療的副作用，提高生活質量[4]。因此，對于中藥復方治療腫瘤的探索逐漸引起人們更多的關注。近年來關于當歸貝母苦參丸治療腫瘤的報道不斷增多，但其作用于前列腺癌的藥理機制鮮有報道。此外，由于中藥復方涉及多成分多靶點的特征，傳統的研究方法很難系統的闡明其整體作用特點。網絡藥理學的出現為研究中藥復方提供了新的方向[5]，其通過系統的理念研究藥物、靶點和疾病之間的關系，以可視化方式展示藥物靶點網絡，并從整體角度研究藥物對生物網絡的影響。本研究借助中藥數據庫，疾病數據庫等工具，結合網絡藥理學研究方法，對當歸貝母苦參丸治療前列腺癌的機制進行整體預測和分析，進一步闡明該復方可能的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 當歸貝母苦參丸活性成分及靶點篩選 本研究 通 過 TCMSP 數 據 庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）查詢該復方的活性成分，其中當歸125種，浙貝母17種，苦參113種。由于生物實驗耗時且成本高的缺點，利用計算機模擬工具鑒定藥物的毒藥物動力學 (absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME)性質現已成為藥物研究中重要方法之一。在本研究中，口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的化合物被選擇用于后續研究。隨后從TCMSP數據庫中獲取每種活性成分的靶蛋白，通過UniProtKB網絡平臺(http：//www.uniprot.org)獲取每種靶蛋白的基因名。

1.2 前列腺癌疾病靶點的獲取 本研究主要通過數據庫檢索以及文獻查詢的方式確定前列腺癌靶點，前者包括 CTD（http：//ctdbase.org/）數據庫與 TTD（https：//db.idrblab.org/ttd/）數據庫，后者主要通過在Pubmed、萬方、知網等文獻檢索網站中查詢。在CTD數據庫中選取相關分數為50分以上的靶點共908個，在TTD數據庫中選取74個靶點，在中英文文獻查詢中選取412個靶點，剔除重復項后共獲取1 203個靶點。

1.3 藥物成分-靶點網絡構建與分析 為了闡明當歸貝母苦參丸復方本身的藥物作用機制，本研究首先通過 Cytoscape 3.2.1（http：//www.cytoscape.org/）網絡分析軟件構建該復方的成分-靶點網絡圖。將前期整理好的當歸、浙貝母、苦參的化學成分以及所對應的靶點以Excell表格形式導入Cytoscape中，并對所得網絡中的每個節點及每個節點間的相互作用關系進行分析。Cytoscape是分子交互網絡數據大規模集成的通用開放碼源軟件。分子和分子相互作用的動態狀態被視為節點和邊的屬性，其核心功能是使網絡布局和數據屬性過度到可視顯示屬性的映射[6]。

1.4 交集靶點PPI網絡構建與分析 為了闡明靶點蛋白在生物網絡系統水平的作用，在獲取當歸貝母苦參丸作用靶點和前列腺癌的疾病靶點后，取二者的交集靶點，導入 STRING 10.5（https：//string-db.org/）在線數據平臺，構建PPI網絡，并進一步通過Cytoscape軟件進行可視化處理。STRING是一種包含已知和預測蛋白相互作用的數據庫，對每一個蛋白相互作用都會進行分值評估，所評估分值越高說明蛋白之間相互作用的置信度越高[7]。通過輸入交集靶點的基因名稱，選擇物種為人類，選取評分≥0.9的蛋白相互作用關系，導入Cytoscape進行分析。

1.5 基因本體論（GO）分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 為了更好說明藥物與疾病交集靶點在基因功能和信號通路中的作用，我們采用DAVID 6.7數據平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）對PPI網絡中的蛋白進行GO富集分析與KEGG富集分析。DAVID生物信息學數據庫能夠通過一些常用的統計學方法如超幾何分布定量（P值）等評估蛋白質生物學功能的顯著性，旨在系統地從大型基因/蛋白質列表中提取生物學含義[8]。

2 結果

2.1 當歸貝母苦參丸成分-靶點網絡分析 通過TCMSP數據庫中篩選出的當歸貝母苦參丸中有效成分共有255個，經過OB值和DL值評估后得到27個有效成分，其中苦參中得到20個，浙貝母中5個，當歸中2個，剔除一個重復項后最終得到26個有效成分，表1列出了度值大于中位數的有效成分信息。將26個有效成分以及其對應的246個靶點導入Cytoscape中進行可視化處理。如圖1所示，該成分-靶點網絡中共包括272節點和544條邊。橙色圓形節點代表藥物成分的Mlo ID，藍色菱形節點代表靶點。邊代表節點之間的相互作用，每個節點的度值代表網絡中與節點相連的邊的數目，節點的尺寸與它們的度值成正比。隨后通過評估網絡集中度以及網絡異構性對該成分靶點網絡進行分析，其集中度和異構性分別為0.543和2.691，說明該成分-靶點網絡空間更偏向于一些成分和靶點。通過度值篩選出網絡中關聯度較高的節點。其中度值較高的成分節點有槲皮素（MOL000098），木犀草素（MOL000006）,芒柄花黃素（MOL000392）等，意味著這些成分作用靶點多且相互作用較強。其中度值較高的靶點包括前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，HSP 90）、雄激素受體（androgen receptor,AR）等，均與前列腺腫瘤的發生發展密切相關。

2.2 藥物疾病交集靶點的PPI網絡分析 通過前期數據挖掘與分子對接，將獲得的藥物與疾病交集靶點輸入STRING數據庫進行分析后，取評分≥0.9的蛋白互作關系數據導入Cytoscape進行進一步分析。如圖2所示，該PPI網絡共有135個節點，節點之前的相互作用關系多達3 066種。通過CytoHubba插件中的Degree、MCC、EPC等算法對網絡中的每個節點進行分析，取每種算法排名前10的靶點綜合后得到34個關鍵基因（圖3）。進一步通過STRING進行關鍵靶點的蛋白關系分析，其中度值最高的為TP53，其次為JUN和PTGS2等。所有的關鍵基因都在前列腺癌的發生發展過程中扮演重要角色。

表1 有效成分基本信息（度＞14）Tab 1 Basic information of active ingredients(Degree＞14)

圖1 成分-靶點網絡圖Fig 1 Component-target network

圖2 交集靶點網絡互作圖Fig 2 PPI Network of intersection targets

圖3 關鍵靶點網絡互作圖Fig 3 PPI Network of key targets

2.3 當歸貝母苦參丸治療前列腺癌的機制分析 通過DAVID數據分析平臺對以上PPI網絡中的135個藥物疾病交集靶點進行GO富集分析以及KEGG富集分析，研究當歸貝母苦參丸治療前列腺癌的可能機制。在GO分析過程中，根據錯誤發現率（false discoveryrate，FDR）共確定了350個條目（FDR＜0.05），其中生物功能所占比例最多，共290個。表2列出了交集靶基因排名前10的生物功能條目，主要涉及細胞增殖調控，細胞凋亡調控等方面。在通路富集分析中，共得到60條KEGG富集通路，其中FDR值＜0.05的共有20條。如圖4所示，主要包括腫瘤信號通路、前列腺癌信號通路、P53信號通路等。根據以上分析結果，將藥物有效成分的作用靶點嵌入前列腺癌發生相關的經典信號通路中，如圖5所示，有效成分所作用的靶點用紅色字體標出，該復方能通過多種靶點發揮其抗腫瘤作用。

圖4 交集靶點京都基因與基因組百科全書通路富集分析結果Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets

表2 交集靶點基因本體論生物功能分析結果Tab 2 GO biological function analysis of intersection targets

圖5 成分-靶點信號通路圖Fig 5 Component-target signaling pathway map

3 討論

當歸貝母苦參丸具有清熱解毒，軟堅散結功效，該復方中的有效成分如槲皮素、多種貝母皂苷、當歸多糖等均具有一定的抗腫瘤作用[9]，關于當歸貝母苦參丸治療前列腺疾病早前已有許多文獻記載[10]。本研究發現該復方成分-靶點網絡中的關鍵成分包括槲皮素和木犀草素等，其度值遠遠高于其他成分。槲皮素是一種廣泛分布于植物界的抗氧化類黃酮物質，其有效的抗誘變和抗增殖作用已在動物體內和體外研究中得到證明[11]，例如，Sun等[12]發現槲皮素與二甲雙胍聯用能夠通過阻斷磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路而起到協同抑制前列腺癌的作用。同樣的，木犀草素作為一種具有生物活性的黃酮類物質，也具有抗炎、抗過敏和抗癌等多種生物學作用。在前列腺癌中，Zhou等[13]發現木犀草素能夠通過抑制E鈣黏蛋白（E-cadherin）而抑制前列腺癌PC3細胞的侵襲能力。此外，該成分—靶點網絡中的關鍵靶點主要有HSP90和PTGS2等。HSP90是一種重要的分子伴侶，抑制HSP90將使其效應蛋白無法維持自身的穩定結構以及正常功能，從而阻斷前列腺癌信號通路中的多個靶點，有效的發揮其抗腫瘤作用[14]。PTGS2（又稱COX-2）水平在腫瘤的早期增生到發生轉移的過程中不斷上調，能夠促進前列腺癌細胞增殖，抑制其凋亡，促進腫瘤血管生成等[15-16]。因此，抑制PTGS2的表達在抑制前列腺癌的過程中具有重要作用。隨后，筆者進一步篩選出當歸貝母苦參丸治療前列腺癌的關鍵基因。通過DAVID數據庫提煉出當歸貝母苦參丸治療前列腺癌的主要功能，這些GO條目中所涉及的細胞凋亡的調控功能，細胞增殖的調控功能以及細胞周期的調控功能等在前列腺癌的發生發展中均具有重要作用。結合KEGG富集通路分析，在筆者繪制的信號通路圖中可以看出，當歸貝母苦參丸能夠通過阻斷PI3K信號傳導途徑抑制細胞的增殖，阻斷絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路進而抑制腫瘤血管的生成。此外，其抗腫瘤機制還可以通過抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPS）來抑制腫瘤的轉移而實現。以上分析充分體現了中藥復方當歸貝母苦參丸治療前列腺癌多靶點的網絡模式，復方中具有多靶點的成分可以通過多種途徑作用于疾病的各個方面，并且產生相互協同效應。通過網絡藥理學方法能夠清晰的闡明每種成分的重要性，為日后研究更為有效的抗腫瘤藥物提供了一定的理論基礎。此外，網絡藥理學作為一種新興的研究方法仍存在一些不足之處，如根據DL值篩選出的草藥成分可能與草藥中的確切成分有所出入，預測目標的準確性或會受到預測工具的影響等。因此，在今后的研究工作中應對草藥成分進行更加全面的分析，同時盡可能采用多種預測工具對預測結果進行綜合分析，并通過實驗對預測出的靶點進行驗證。