異丙酚通過誘導幼鼠海馬神經元線粒體自噬減輕其肝缺血再灌注后腦損傷

呂景淑，賈莉莉，喻文立

（1.天津醫科大學一中心臨床學院麻醉科，天津300192；2.天津市第一中心醫院麻醉科，天津300192）

肝移植是終末期肝病患兒的唯一治療手段。隨著手術技術和術后管理的進步，兒童肝移植患者術后5年生存率高達80%以上[1]。2012年以后，每年嬰幼兒患者為主的膽道閉鎖在我國兒童肝移植中的占比達到75%以上[2]。然而，大多數患兒都會發生術后神經系統并發癥[3]，發生率在9%～48%之間，且明顯高于成人。肝缺血再灌注是肝移植術中必不可少的步驟，研究證明，該過程可造成多個遠隔臟器如：心、肺、腎、腦、腸等的損傷[4]。異丙酚是臨床上常用的麻醉藥，大量實驗證明，它可通過抑制小膠質細胞活化[5]，抑制內質網應激介導的凋亡[6-7]，減輕炎癥反應[8]等多種途徑發揮腦保護作用。線粒體自噬是選擇性自噬的一種，對于維持細胞內和組織內的穩態具有重要的作用。關于異丙酚對肝缺血再灌注后幼鼠海馬神經元線粒體自噬的影響研究甚少，本研究就此進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 2周齡C57BL/6雄雌不分的小鼠，體質量約6～8 g（華阜康生物科技股份有限公司提供），飼養在干凈、恒溫恒濕的環境中，自由攝取食物和水。隨機分為4組：假手術組(S組)，肝缺血再灌注組（IR組），異丙酚組（P組），異丙酚+自噬抑制劑3-MA組（3-MA組）。

1.2 動物模型的構建 參照文獻[9]建立小鼠70%肝熱缺血再灌注模型。術前采用50 μg/g的戊巴比妥腹腔內注射麻醉，麻醉后將小鼠固定在手術臺上，沿腹白線縱行切口入腹，暴露手術視野，應用棉簽將肝門附近腸管等臟器輕輕推至左髂區，游離第一肝門。用血管夾夾閉肝左、中葉脈管（門脈、動脈與膽道）的共干，此時缺血肝葉變白，淤血肝葉顏色加深，70%的肝臟熱缺血模型造模成功。將腹腔內臟器歸位，臨時合攏腹腔，用無菌紗布遮蓋腹壁切口，缺血1 h后松開血管夾，隨后關腹縫合切口。S組僅開腹、游離第一肝門以及1 h后關腹等操作，無血管夾閉，P造模前30 min腹腔注射異丙酚（20 mg/kg,阿斯利康，美國），3-MA組造模前30 min腹腔注射異丙酚 20mg/kg和5μL溶于PBS的3MA（100 nmol/μL），S和IR組在開腹前30 min腹腔內注射等量乳化劑。該模型動物死亡率約為10%，4只老鼠多死于造模初期，死亡原因主要包括麻醉意外致死（2只），手術過程粗暴導致流血過多（1只），血管夾閉過深（1只），每死亡1只即刻重新造模補齊該組的數目。

1.3 標本采集與制作 再灌注后6 h，各組小鼠摘眼球取血標本，3 500 r/min離心15 min，取血清，保存于-80℃以待檢測ELISA。剝離完整腦組織，一份用多聚甲醛固定保存，以備后期的石蠟切片。快速分離腦組織中的海馬組織，用刀片切取海馬CA1區1 mm×1 mm×1 mm組織塊保存在2.5%戊二醛固定液置于4℃冰箱，以備觀察透射電鏡。將海馬組織保存于-80℃冰箱，用于后期檢測Westernblot。

1.4 ELISA法測腦損傷標志物及炎癥因子 參照南京建成生物有限公司的試劑盒說明書，采用雙抗體夾心法，經包被、加樣、加酶標抗體、加底物顯色、終止反應等步驟，最后計算出各組NSE、S100β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.5 透射電鏡法觀察自噬小體和線粒體形態 取出2.5%戊二醛固定液固定后的海馬組織標本，PBS沖洗3次，1%四氧化鋨固定液固定1 h，PBS清洗3次，在丙酮和雙蒸水按比例配制50%、70%、80%、90%、100%（V/V）的濃度梯度進行脫水，進行包埋滲透，制成超薄切片60 nm，用1%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察每個標本海馬神經元內自噬小體和線粒體的形態結構。

1.6 Western blot法測 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3 蛋白的表達情況 取冰凍海馬組織，進行稱重，研磨，以質量：體積=1∶10的比例加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑。腦組織勻漿放冰上裂解，每隔10 min震蕩1次，30 min后，4℃13 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法進行蛋白定量。配制12%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，蛋白上樣量為50 μg，隨后轉印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），室溫下5%脫脂牛奶封閉1h，TBST洗3次，每次10min，隨后加入 1：1 000 一抗 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3（均購于美國CST公司），置于4℃冰箱孵育過夜。TBST清洗3次，每次10 min；加入1：2 000 HRP標記山羊抗兔IgG二抗（購于北京中杉金橋公司），于室溫下搖床孵育1h，TBST清洗3次，每次10 min；加入顯色液避光顯影曝光，系統照相記錄實驗結果。采用ImageJ圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值，以LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3 分別與內參 β-actin（1∶1 000，購于美國CST公司）灰度值的比值反應目的蛋白的表達水平。

1.7 統計學處理 用SPSS 19.0進行統計學分析處理。正態分布計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。GraphPadPrism 6制造圖表分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦損傷標志物及炎癥因子的表達水平 與S 組相比，IR 組、P 組、3-MA 組 NSE、S100β、IL-6、TNF-α均有所增加，且差異具有統計學意義（P＜0.05），與IR組相比，P組的各項指標下降，3-MA組各項指標上升，且差異具有統計學意義（P＜0.05）（表 1）。

表 1 血清 NSE、S100β、IL-6、TNF-α 濃度的比較（n=10，±s）Tab 1 concentrations of NSE,S100β,IL-6 and TNF-α（n=10，±s）

表 1 血清 NSE、S100β、IL-6、TNF-α 濃度的比較（n=10，±s）Tab 1 concentrations of NSE,S100β,IL-6 and TNF-α（n=10，±s）

與 S組比較，aP＜0.05；與 IR 組比較，bP＜0.05

組別NSE/（ng/mL）S100β/（mg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）S 組 14.21±0.76 1.34±0.06 36.7±2.9 42.5±4.3 IR 組 30.14±1.71a 2.06±0.13a 119.7±6.2a 105.7±6.1a P 組 23.94±2.14ab 1.73±0.08ab 78.2±3.1ab 70.5±5.9ab 3-MA 組 38.66±0.87ab 2.38±0.07ab 131.7±5.2ab 113.7±8.6ab

2.2 各組自噬體及線粒體結構 透射電鏡可觀察到自噬小體和線粒體超微結構，兩組結果綜合提示：與S組相比，IR組、P組、3-MA組線粒體數量均有所下降，且線粒體形態結構紊亂，線粒體腫脹增加，自噬小體增多;與IR組相比，P組線粒體數量增多，線粒體結構較完整，自噬小體數量增多，3-MA組，線粒體數量和質量均下降，且自噬小體數量減少（圖 1）。

圖1 各組電鏡結果的比較（×5 000）Fig 1 Results of TEM in each group(×5 000)

2.3 各組LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白的表達情況與 S組相比，IR 組、P組、3-MA 組的 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白表達水平上升，且差異具有統計學意義（P<0.05），與 IR 組相比，P組的 LC3Ⅱ、Nix蛋白表達水平上升，但Caspase-3蛋白表達水平下降，3-MA組的 LC3Ⅱ、Nix蛋白表達水平下降，但Caspase-3蛋白表達水平上升，差異均具有統計學意義（P<0.05）（圖 2）。

圖2 各組LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白的表達情況Fig 2 expressionsofLC3Ⅱ,NixandCaspase-3proteinsineachgroup

3 討論

3.1 線粒體自噬在肝缺血再灌注之腦損傷中的作用 自噬是細胞通過溶酶體降解蛋白和受損細胞器的過程，選擇性清除線粒體即為線粒體自噬。線粒體自噬是細胞實現線粒體質量控制的主要途徑，對維持細胞穩態至關重要。Nix是定位于線粒體外膜的類BNIP3蛋白，參與了線粒體自噬的Parkin非依賴途徑。有文獻報道，其氨基酸序列中含有WXXL基序。Nix能通過該基序與 LC3及LC3同源物CABA受體相關蛋白結合，誘導線粒體自噬發生從而降解清除多余的線粒體。Zhang等證明了在低氧的情況下，可以通過BNIP3依賴的方式誘導激活線粒體自噬[10]。Wu等研究發現在缺氧狀態下，Nix可激活線粒體自噬[11]。有研究表明，Sirt1可通過恢復線粒體自噬水平減輕肝缺血再灌注損傷[12-13]。然而，SONG等實驗研究顯示FOXO3a可通過抑制肝細胞線粒體自噬和抑制細胞凋亡減輕小鼠肝缺血再灌注損傷[14]。

在本實驗中，相對于S組，IR組的透射電鏡結果顯示自噬小體數量增加，且線粒體腫脹明顯，線粒體自噬相關蛋白Nix、LC3Ⅱ表達量增高，凋亡蛋白Caspase-3表達量增多，腦損傷標志物NSE、S100β和炎癥因子IL-6、TNF-α水平也明顯增加，然而加入自噬抑制劑3-MA后，線粒體自噬水平明顯降低，但電鏡結果顯示損傷的線粒體數量反而增加，凋亡蛋白Caspase-3及腦損傷標志物NSE、S100β和炎癥因子IL-6、TNF-α水平進一步增加。以上結果說明，肝缺血再灌注后，線粒體自噬可能起到保護作用，通過及時清除受損的線粒體，以抑制其釋放氧化自由基，從而控制氧化應激損傷，抑制該過程則會引起炎癥反應加劇，凋亡增加。

3.2 異丙酚對肝缺血再灌注后小鼠海馬神經元線粒體自噬的影響 異丙酚是臨床常用的靜脈麻醉藥，現已有多項研究證明異丙酚可對自噬產生影響。Kim 等[15]、Chang 等[16]、Li等[17]、Yoon 等[18-19]均證實了異丙酚誘導自噬的產生，減輕氧化應激損傷。然而，Cui等[20]、Li等[21]、Chen 等[22]、Yang 等[23]研究卻發現異丙酚可抑制自噬從而發揮保護或加重損傷的作用。

本實驗研究中，與IR組相比，P組，透射電鏡結果顯示自噬小體數量增加，且線粒體結構破壞減少，線粒體自噬相關蛋白Nix、LC3Ⅱ表達量增高，而凋亡蛋白Caspase-3表達量卻下降，腦損傷標志物NSE、S100β和炎癥因子IL-6、TNF-α水平也明顯降低，該實驗結果說明，線粒體自噬本身在肝缺血再灌注后起一定的保護作用，然而，IR組自噬流或許受到了一定的抑制，異丙酚可恢復肝缺血再灌注線粒體自噬流的抑制作用，或者，異丙酚可進一步激活線粒體自噬，從而起到保護作用。

3.3 本實驗的不足及臨床應用建議 本實驗研究僅僅從腦損傷標志物和凋亡蛋白水平研究其對大腦的影響，顯然不足以對其腦保護作用下結論，并且本實驗為短期實驗，未研究其長期的影響結果。本實驗樣本數量偏小，結論需大量動物實驗和臨床實驗加以證實。關于異丙酚誘導線粒體自噬的機制及其上下游的影響因素未進行探討。今后應繼續探索其具體信號通路，積極尋找在肝缺血再灌注中的腦保護措施。