RRM1 mRNA與吉西他濱藥物膀胱灌注治療膀胱癌療效的關系

劉志飛 ，張志宏 ，邢力永 ，朱研峰 ，石 鵬 ，鄧 剛

（1．天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211；2.唐山市人民醫(yī)院泌尿外科，唐山063000）

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，隨著社會發(fā)展，人們生活水平的提高，目前其發(fā)病率愈發(fā)升高，且明顯呈現(xiàn)低齡化趨勢，經尿道膀胱腫瘤電切術后非肌層浸潤性膀胱癌患者在早期及時給予膀胱灌注吉西他濱藥物已作為一種較好的輔助治療方案，然而，目前對于如何監(jiān)測非肌層浸潤性膀胱癌患者對吉西他濱藥物的敏感性尚待進一步解決。國外學者已經研究發(fā)現(xiàn)核糖核苷還原酶M1亞單位基因（RRM1）表達水平與膀胱癌患者生存時間有重要關系，通過檢測RRM1的表達水平可以評估膀胱癌患者膀胱灌注化療藥物的敏感程度，對臨床上選擇輔助治療方案具有重要指導意義[1]。本研究通過DNA基因液相芯片技術檢測膀胱癌組織中RRM1的表達水平，分析RRM1與膀胱癌患者各項臨床指標的相關性及與膀胱灌注吉西他濱藥物療效的敏感性，旨在為日后臨床上膀胱癌患者術后行膀胱灌注治療選擇最佳化療藥物提供一定的指導依據(jù)[2]。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析唐山市人民醫(yī)院自2013年1月-2017年3月的40例行經尿道膀胱腫瘤電切術的非肌層浸潤性膀胱癌患者。患者年齡為31～78歲，中位年齡為（57.6±8.9）歲；男性患者 23例，女性患者17例；腫瘤最大直徑0.8～3.5 cm，直徑≥2 cm為16例，直徑＜2 cm為24例；腫瘤單發(fā)為23例，腫瘤多發(fā)為17例。術后病理結果顯示均為非肌層浸潤性尿路上皮癌，其中高級別尿路上皮癌患者18例，低級別尿路上皮癌患者22例。術后所有患者均行吉西他濱藥物膀胱灌注1年（吉西他濱注射液1 g與50 mL 0.9%NaCl注射液配組灌注，保留灌注時間1 h，初始為1次/周，共計8周，后改為1月/次，共計8月），術后隨訪膀胱灌注吉西他濱藥物的膀胱癌患者復發(fā)情況，通過行泌尿系彩超、CT、膀胱鏡檢查診斷患者是否出現(xiàn)術后復發(fā)，隨訪1年期間膀胱癌復發(fā)患者6例（表1）。

表1 RRM1 mRNA的表達與膀胱癌臨床病理特征的關系（例）Tab 1 Relationship between the expression of RRM1 mRNA and the clinicopathological features of bladder cancer(cases)

1.2 實驗方法 取適量術后新鮮標本組織與裂解液混勻，溫度設為65℃，1 400 r/min振蕩孵育2 h。然后溫度設為25℃，13 000 r/min離心5 min，取上層清液，作為樣本檢測。將上層清液轉移至96孔板，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，溫度調為54℃，750 r/min振蕩14～18 h。次日將孵育板放在磁力架上1 min，棄去上層清液。加入洗滌液，震蕩洗滌1 min，棄去上層清液；重復洗滌4次。加入擴增延伸探針和標記探針，溫度設為45℃震蕩反應1 h；棄去上層清液；用洗滌液洗3次；加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，溫度設為50℃震蕩反應30min；用洗滌液洗2次；加入洗滌液，震蕩5 min，于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)，分析實驗數(shù)據(jù)（本實驗檢測出的物質為mRNA，本研究以mRNA體現(xiàn)蛋白表達水平）。

1.3 結果判定 通過讀取Luminex IS2.3儀器顯示結果，其中RRM1 mRNA在膀胱癌組織中檢測表達率＜50%為低表達，≥50%為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0醫(yī)學統(tǒng)計軟件，描述分析40例膀胱癌患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤單發(fā)或多發(fā)、腫瘤組織分級、RRM1 mRNA的表達水平等臨床病理特征的分布情況，對RRM1 mRNA的表達及其與非肌層浸潤性膀胱癌患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤單發(fā)或多發(fā)、腫瘤組織分級等臨床病理特征的關系及RRM1 mRNA的表達水平與吉西他濱藥物敏感性的相關性采用χ2檢驗、Fisher確切概率法進行統(tǒng)計分析，將P＜0.05作為其間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

40例非肌層浸潤性膀胱癌患者中檢測出RRM 1 mRNA高表達為16例，表達率為40%；RRM1mRNA低表達為24例，表達率為60%。RRM1 mRNA的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤單發(fā)或多發(fā)等參數(shù)無顯著相關。

膀胱癌患者RRM1表達水平與膀胱癌分級的關系（表2），RRM1在高級別膀胱尿路上皮癌患者中呈現(xiàn)高表達為12例（30%），呈現(xiàn)低表達為6例（15%）；在低級別尿路上皮癌患者中高表達為4例（10%），低表達為18例（45%）。高級別尿路上皮癌與低級別尿路上皮癌患者中RRM1表達水平行χ2檢驗（1），所以 P＜0.05，因此高級別膀胱癌患者與低級別膀胱癌患者中RRM1表達水平差異有統(tǒng)計學意義，高級別尿路上皮癌患者中RRM1水平呈現(xiàn)高表達，低級別尿路上皮癌患者RRM1水平呈現(xiàn)低表達。

表2 RRM1在不同病理分級膀胱癌中的表達情況(例)Tab 2 Expression of RRM1 in bladder cancer with different pathological grades(cases)

膀胱癌患者RRM1的表達水平與膀胱灌注吉西他濱藥物治療效果敏感性關系（表3）：術后隨訪膀胱灌注吉西他濱藥物的膀胱癌患者復發(fā)情況，其中RRM1低表達的患者復發(fā)1例（2.5%），RRM1高表達的患者復發(fā)5例（12.5%），RRM1高表達患者復發(fā)率是RRM1低表達患者的5倍，統(tǒng)計學分析χ2=6.3 ＞χ20.052（1），所以 P＜0.05，表明經吉西他濱藥物膀胱灌注的膀胱癌患者中RRM1高表達的尿路上皮癌患者復發(fā)率明顯高于RRM1低表達的尿路上皮癌患者，所以吉西他濱藥物在RRM1低表達膀胱癌患者中療效優(yōu)于RRM1高表達患者。

表3 RRM1與吉西他濱藥物敏感性關系(例)Tab 3 Relationship between RRM1 and the sensitivity of gemcitabine drug(cases)

3 討論

非肌層浸潤膀胱癌患者行經尿道膀胱腫瘤電切術（TUR-BT）術后早期進行膀胱灌注敏感的化療藥物可以降低患者術后腫瘤的復發(fā)[3]，同時也有學者研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者術后行膀胱內灌注化療藥物，術后復發(fā)率仍可達60%[4]。核糖核苷還原酶M1亞單位基因（RRM1）為DNA修復過程的限速酶[5]，定位于染色體11P15.5，這個染色體區(qū)域命名為L0H11A。Bergman研究表明RRM1基因是促使吉西他濱產生耐藥的關鍵性靶點[6]。吉西他濱進入機體后，其吉西他濱RR的活性被吉西他濱磷酸化產物所競爭性抑制，導致dNTPs少量生成或不再生成，由于dNTPs是DNA合成所必需的底物[7]，所以抑制RR的活性便可以阻止DNA的合成從而誘導細胞凋亡，達到阻止腫瘤細胞增殖的目的[8]。有相關文獻報道非小細胞肺癌患者在進行鉑類及吉西他濱聯(lián)合化療時，mRNA表達水平較低的患者化療后具有相對較長的生存期，表明RRM1基因是研究吉西他濱耐藥的一個主要指標[9]。Reynolds等[10]研究發(fā)現(xiàn)，RRM1和ERCC1蛋白表達水平與化療有效率之間具有顯著的相關性，高表達者有效率低，二者在膀胱癌患者術后膀胱灌注化療藥物中有何作用仍需進一步研究，該研究結果將會在臨床上為患者提供個體化治療方案[11]。

本文結果表明RRM1的表達水平與膀胱癌腫瘤分級呈現(xiàn)正相關關系，經吉西他濱藥物膀胱灌注的膀胱癌患者中RRM1低表達的尿路上皮癌患者復發(fā)明顯低于RRM1高表達的尿路上皮癌患者，由此表明嘧啶類藥物在RRM1低表達膀胱癌患者中療效優(yōu)于RRM1高表達患者。高級別尿路上皮癌與低級別尿路上皮癌患者術后均可出現(xiàn)復發(fā)，筆者發(fā)現(xiàn)高級別尿路上皮癌患者中RRM1 mRNA高表達者對吉西他濱藥物灌注療效差，易出現(xiàn)復發(fā)，而低級別膀胱癌患者中RRM1 mRNA高表達者同樣對吉西他濱藥物灌注療效差容易出現(xiàn)復發(fā)，這表明RRM1 mRNA表達水平與吉西他濱藥物灌注療效呈負相關關系。此結果與國內外多位學者研究相符。RRM1表達水平與患者預后有密切相關性，其表達狀況直接影響化療藥物的選擇，RRM1活性升高或表達水平升高均會導致化療藥物的耐藥性產生。因此，非肌層浸潤性膀胱癌患者行膀胱灌注治療前通過檢測RRM1基因表達水平，有助于判斷吉西他濱藥物敏感性，可以為患者選擇最敏感的膀胱灌注藥物提供一定指導依據(jù)，由于本研究數(shù)據(jù)有限，可能存在一定偏倚，尚需擴充研究對象數(shù)量以進一步探討RRM1在膀胱灌注治療選擇合理藥物中的重要性。