冠心病患者外周血中lncRNA-ANRIL的表達水平及其臨床意義

王 娜 ，張學軍

（1.天津醫科大學免疫學系,天津300070；2.天津市濱海新區大港醫院檢驗科,天津300100）

冠心病引起的心肌梗死等卒中性疾病目前依然是全球人口死亡和殘疾的主要原因[1-2]。盡管目前心血管介入治療技術發展迅速，但仍有相當大比例的冠心病患者在早期未能準確診斷，并且在心梗發作時不能得到有效的救治，急性冠脈綜合征等冠心病嚴重階段將會對心肌細胞造成嚴重損害，最終導致心肌細胞壞死、凋亡、肥大或纖維化。目前研究發現冠心病所致心肌損傷的一部分機制是通過基因表達的下調而誘導的，非編碼RNAs被任意分為短非編碼RNAs(microRNA，20~22個核苷酸長)和長非編碼 RNAs(lncRNAs，200 個核苷酸)。miRNAs主要通過調節靶信使RNA的功能來下調基因表達[3]，但lncRNAs對基因表達的調控更為復雜，包括激活或抑制基因表達、調節染色質結構等[4]。目前多項研究報道lncRNA已經成為腫瘤學領域中進行診斷的新的生物標志物以及腫瘤治療的新靶點[4-5]，然而，筆者對lncRNAs在心血管疾病中的作用認識還處于初步階段，本研究主要探索了lncRNA-ANRIL于冠心病病人外周血清中的表達及其診斷意義，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年2月-2018年2月來自天津市大港醫院行冠狀動脈CT造影或冠脈CT的患者231例，定義為冠心病組，男性189例，女性42例，平均年齡（63.42±10.75）歲；同時選取健康志愿者447例，定義為對照組，男性359例，女性88例，平均年齡（61.17±9.84）歲。冠心病組納入標準：冠脈CT造影檢查：右冠狀動脈、左回旋支、左前降支、左主干的主要血管，根據Judkins標準：每個血管進行至少3個多體位頭測定，結果示≥1支血管直徑出現超過50%的狹窄確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。排除標準：伴有嚴重肝腎功能不全、周圍血管性疾病、腫瘤、血液系統疾病、急慢性感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常、瓣膜性心臟病等。

1.2 主要實驗試劑 Trizol試劑購自invitrogen公司，根據圖1 9p21區域基因轉錄圖譜，選擇lnc RNA-ANRIL、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH 基 因 作為引物合成對象，上下游引物由武漢金凱瑞公司合成。SYBR GREEN Master Mix與逆轉錄試劑盒均購自賽默飛世爾公司。

圖1 9p21區域基因轉錄圖譜Fig 1 9p21 regional gene transcription map

1.3 血液樣品采集 抽取兩組患者晨起空腹肘靜脈血7 mL于EDTA抗凝管中，控溫離心機4℃，3000 r/min離心血液樣本15min，取上層清液即血清進行后續實驗測定。本實驗經過醫院倫理委員會討論通過，受試者均簽署知情同意書。

1.4 血清總RNA提取及cDNA第一鏈合成 取100 μL 血清，加入 900 μL Trizol，于室溫下充分混勻15 min，加入 200 μL 氯仿，劇烈震蕩 15 s，室溫下靜置后4℃，12 000 r/min離心15 min，取上層清液450 μL，加入 450 μL丙二醇，輕柔顛倒混勻后再次相同條件離心15 min，此時可見RNA白色沉淀，75%乙醇潤洗兩次后DEPC水溶解，調節各樣品RNA濃度均在1 000 ng/μL之內，按照逆轉錄試劑盒說明：各樣品均取 1μgRNA，1μLoligo（dt）（5 μg/μL）,補 DEPC水至12 μL，65℃反應5 min后迅速至冰上，加入 5×buffer 4 μL，RNase 抑制劑（20 U/μL）1 μL，RT 1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，42 ℃孵育1 h，70℃孵育5 min后冰上冷卻即完成逆轉錄。

1.5 RT-PCR法測定外周血中ANRIL等相關指標的表達情況 通過Genebank中的ANRIL、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH的序列，使用primer 6.0軟件設計引物，ANRIL外顯子 1-2上游引物序列為：GCGCTGCCGGAGCTG,下游引物：CAGCATGGACA CCAATATTCTCTC，MGB 探針：CCGGACTAGGACT ATT。外顯子17-18上游引物：GCAATTCCAGTGCA AGTATGGTC，下游引物：CCACAATGTTCAACTTGCTGT，MGB 探 針 ：TGATCCAGT AGTATCTTAC。 其 中CDKN2A基因第一外顯子引物為上游5′-ACC CTG TCC CTC AAA TCC TC-3′，下游 5′-TGG CTC CTC ATT CCT CTT CCT T-3′；第二外顯子引物為上游5′-CAT CTA TGC GGG CAT GGT TA-3′，下游 5′-TGC AGC ACC ACC AGC GTG TC-3′；內對照 β-珠蛋白為上游 5′-CGG GAA ATC GTG CGGAC-3′，下游5′-TCG CTC CAA CCG ACT GCT-3′。CDKN2B 基因上游 5′-CTATGTTTGAATAATTCCAG-3′，下游基因5′-CGCGTCGCCGCGUUAAGAAC-3′。建立10μL反應體系：2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL。RTPCR 反應設置為：95℃反應30 s，35個循環設定：95℃ 10 s、60℃30 s。通過循環數2△△ct法計算血清中各指標的表達情況。

1.6 SNP檢測9p21基因區域3種單核苷酸多態性 正常及對照病人的血液樣本，提取其基因組DNA，利用Illumina Gold-en Gate技術和Bead Studio軟件包進行SNP分型，所有SNP基因型測序準確率為98%。

1.7 統計學分析 通過SPSS18.0軟件對實驗數據進行分析，計數資料采用χ2檢驗，計量資料以±s表示，兩兩比較采用組間t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 lnc RNA-ANRIL表達與冠心病相關性比較分析 冠心病組 ANRIL（外顯子1-2）與 ANRIL（外顯子17-18）的相對表達量均明顯小于對照組（均P＜0.01），見表1。通過ROC曲線可知ANRIL（外顯子1-2）對于診斷冠心病具有顯著統計學意義（P＜0.001），曲線下面積為 0.894（95%CI 0.835~0.953），最佳臨界值（cut off值）為：0.945 0，敏感性為：50.88%，特異度為98.25%。ANRIL（外顯子17-18）對于診斷冠心病也具有顯著統計學意義（P＜0.001），曲線下面積為 0.793（95%CI 0.711~0.875）,最佳臨界值（cut off值）為1.10，敏感性為45.61%，特異度為94.74%，見圖2。

表1 兩組lnc-ANRIL相對表達量比較Tab 1 Comparison of relative expression of lnc-ANRIL between the two groups

圖2ANRIL診斷冠心病ROC曲線分析Fig 2 ROC curve analysis of the diagnosis of coronary heart disease by ANRIL

2.2 9p21區域單核苷酸多態性與冠心病相關性比較分析 對冠心病組及對照組測定了9p21基因區域 3 種單核苷酸：rs1333049、rs564398、rs2811712 的多態性分布情況。結果顯示：rs1333049等位基因頻率在兩組受試者中具有顯著差異（P＜0.05），其中冠心病組等位基因G顯著低于對照組（P＜0.05），而rs564398與rs2811712等位基因頻率在兩組間的比較并無統計學意義（P＞0.05），見表 2，圖 3。

2.3 rs1333049等位基因頻率G與lnc-ANRIL表達的相關性分析 分別測定了冠心病組rs133049等位基因G的分布與ANRIL（外顯子1-2）、ANRIL（外顯子17-18）的相關性，發現兩者均呈正相關（r=0.340 2/0.312 4，均 P＜0.05），見圖 4。

表2 兩組單核苷酸等位基因頻率比較Tab 2 Comparison of rs1333049 single nucleotide allele frequencies between the two groups

圖3 兩組rs1333049基因型人數頻率比較Fig 3 Frequency comparison of rs1333049 genotypes in the groups

圖4 rs1333049等位基因G與ANRIL相關性分析Fig 4 Correlation analysis of rs1333049 allele G and ANRIL

2.4 lnc RNA-ANRIL表達與 CDKN2A、CDKN2B表達的相關性分析 分別測定了冠心病組lnc-RNA表達與CDKN2A、CDKN2B表達的相關性，結果示：lnc RNA-ANRIL（外顯子1-2）與CDKN2A、CDKN2B表達均呈正相關（均 P＜0.05），lncRNAANRIL（外顯子17-18）與CDKN2A的表達呈正相關（P＜0.0001），而與CDKN2B的表達無相關性（圖5）。

圖5 ANRIL與CDKN2A、CDKN2B表達的相關性分析Fig 5 The correlation analysis of the expressions of ANRIL,CDKN2A and CDKN2B

3 討論

本研究主要探索了lncRNA-ANRIL于冠心病病人中的表達及其臨床意義，lncRNA-ANRIL屬于長鏈非編碼RNA，既往研究將lncRNA-ANRIL鑒定為與多種疾病相關的遺傳易感性位點，這些疾病包括2型糖尿病、顱內動脈瘤及多種癌癥[6]。lncRNA ANRIL基因位于染色體9p21區域，全長3.8 kb，在人體內多種正常組織中均有表達。ANRIL基因序列的最后一個外顯子與9p21心血管疾病相關基因位點相鄰，因此我們同時分析了9p21基因區域單核苷酸的表達與之相關性。本研究涉及的另外兩個指標：CDKN2A和CDKN2B（編碼p15KIK4B，P16UK4A和p14ARF）為兩個細胞周期依賴性激酶抑制劑，位于lnc-RNA ANRIL關聯點附近，該兩種激酶抑制劑均在細胞增殖中發揮了關鍵作用，并且在該過程中可有效吸附其它激酶。在細胞生長過程中，CDKN2A/B被多梳蛋白所抑制，于細胞生長過程中出現激活[7]。

目前有證據表明ANRIL可通過組蛋白修飾調節CDKN2A/B基因表達的作用。ANRIL可通過調節CDKN2A從而發揮調節細胞衰老的作用，并且表現出衰老依賴的增殖作用[8]。ANRIL轉錄后可與Chrimbox 7（CBX7亞基的多梳抑制復合物1）整合從而沉默p16INK4A(CDKN2A)，并且可吸附多克隆抑制復合物 2（PRC2）從而沉默 p15INKB（CDKN2B）的表達[9]。此外，ANRIL是CDKN2B基因的反義物，對于CDKN2B有義序列的表達具有抑制作用。因此，在基因敲除ANRIL的情況下，CDKN2B位點的抑制將被削弱，CDKN2B將出現上調[10]。筆者的研究發現ANRIL的減少與增多與CDKN2A表達呈正相關，PR復合假說并不能解釋該種機制，這種減少似乎是由另一種機制所引起的。盡管目前的研究報道了ANRIL可通過多梳蛋白抑制CDKN2A/B基因座中的作用，但是ANRIL的每個剪接變體的具體作用以及轉錄物的所有可能功能仍然缺乏相應的研究。因此本實驗分別探討了ANRIL（外顯子1-2）、ANRIL（外顯子17-18）對于CDKN2A/B表達的相關性。

染色體9p21區域中與疾病相關的單核苷酸表達極為豐富，與該位點相關的一些基因表型與動脈粥樣硬化性疾病、心肌梗死、顱內動脈瘤和2型糖尿病有關[11-14]。此外，與其它遠緣病因的疾病，如黑素瘤、皮膚痣、白血病、牙周炎和阿爾茨海默病、子宮內膜異位癥和青光眼均有關聯[15-19]。全基因組關聯研究（GWAS）目前也已經確定了染色體9p21位點基因的遺傳變異與心血管疾病的發生具有關聯性[20]。因此本研究測定了冠心病組及對照組9p21基因 區 域 3 種 單 核 苷 酸 ：rs1333049、rs564398、rs2811712的表達情況，該3種SNPs均在其它疾病中具有差異性的表達，分析了其不同基因型在冠心病病人中的差異性表達。

通過本次研究筆者發現：SNP rs1333049不同基因型的表達在冠心病人群與健康人群中存在顯著差異，rs1333049單核苷酸等位基因G的下降可能與動脈粥樣硬化相關，進一步研究等位基因G與ANRIL表達的相關性發現，該兩者表達存在正相關，說明染色體9p21區域單核苷酸rs1333049等位基因可能參與調控了ANRIL的表達；此外冠心病病人血清中ANRIL的表達均低于正常受試者，通過ROC 曲線可以發現 ANRIL（外顯子 1-2）、ANRIL(外顯子17-18)在診斷冠心病方面均具有統計學意義，ANRIL可以作為診斷冠心病發病的高特異性指標；最后本實驗發現ANRIL（外顯子1-2）與CDKN2A、CDKN2B表達均呈正相關，ANRIL(外顯子17-18)與CDKN2A的表達呈正相關。

綜上所述，ANRIL可能通過調控CDKN2A/B的表達影響冠心病的發生發展，ANRIL的表達可能受染色體9p21區域單核苷酸rs1333049表達的影響，外周血ANRIL的表達可以作為早期診斷冠心病的特異性指標。