響應面法優化紫外線處理后雙孢菇中維生素D2皂化工藝

張月，沈雅萍，李利利，王鳳玲，關文強

(天津商業大學 生物技術與食品科學學院，天津市食品與生物技術重點實驗室，天津，300134)

食用菌，俗稱“蘑菇”，是一類可供食用的大型真菌。我國對食用菌的認識利用可以追溯到公元前4000年到公元前3000年的仰韶文化時期[1-2]。食用菌味道鮮美、風味獨特，富含蛋白質、多糖、氨基酸等多種營養成分，具有一定的抗腫瘤、降血壓等藥學功效[3-4]。雙孢菇為世界范圍內栽培量較大的食用菌之一，因其菇體潔白、風味獨特受到消費者的廣泛歡迎。

近年來，大量實驗研究表明，雙孢菇中大量的麥角甾醇在紫外線的作用下會轉化為VD2[5-11]，對人類健康具有重要價值。VD2為VD家族的重要一員，在人體內主要起調節鈣磷代謝平衡的作用。VD的缺乏會導致骨質疏松、軟骨病等病癥，且與高血壓、中風、糖尿病等有重要關系[12-13]。VD主要來自動物性食物，食用菌是極其稀少的天然植物性食物來源[14]，可以預計，未來食用菌中的VD2將成為VD的一個主要來源。因此，食用菌中的VD2調控、分析及應用將擁有廣闊的前景。

VD2的提取方法主要分為皂化法[15-19]和非皂化法[20-22]。非皂化法雖然提取時間較短，但提取過程要加入二甲基亞砜等易致毒試劑作為破壁劑，危險系數較大，故未能得到廣泛使用。皂化法即將樣品加入堿和醇進行皂化反應，使脂類轉變成水溶性的皂化產物，釋放出其包裹的VD2[23]，然后用有機溶劑提取，反應條件溫和，操作簡單，成為VD2的主要提取方法。VD2的皂化工藝影響著食用菌中VD2的準確定量，因而建立可靠可行的皂化工藝尤為重要。

響應面法是一種最為常用統計學方法，利用有限次試驗得到數據來建立因素與響應值之間的函數模型，由部分推斷整體，從而獲得最佳工藝條件[24-26]。目前為止，尚未有利用響應面法優化食用菌中VD2皂化工藝的研究報道。本文以紫外線處理后的雙孢菇為實驗材料，通過單因素實驗及響應面實驗優化VD2的皂化工藝，為食用菌中VD2的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VD2(50-14-6)，美國ChemService公司；雙孢菇，天津市閩中食用菌種植基地；甲醇(色譜純)天津市光復科技發展有限公司；無水乙醇、正己烷，分析純天津市風船化學試劑科技有限公司；實驗室用水為超純水。

LC-10ATVP高效液相色譜儀，日本島津；Milli-Q水純化系統，美國Millipore公司；短波紫外照射裝置，天津天商冰源科技發展有限公司；短波紫外燈管天津瑞森特紫外線設備有限公司；UVX-25 紫外照度計，美國UVP公司；FD-2真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；RE-52A 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙孢菇紫外線處理

選擇品質較好、大小均一的雙孢菇均勻置于紫外燈(波長254 nm)下，先將菌蓋垂直向上，照射200 s，然后手動翻轉，菌柄照射相同時間，照射距離20 cm，照射強度1 000 μW/cm2，計算得照射劑量為每面2.0 kJ/m2。照射完成后，將雙孢菇置于-80 ℃冰箱冷凍48 h后放入真空冷凍干燥機內，真空度約為10 Pa，冷阱溫度為-80 ℃，干燥時間為60 h。將干燥后的雙孢菇研磨成粉，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2.2 VD2皂化提取工藝

準確稱取雙孢菇粉末1.00 g，加入4 mL抗壞血酸鈉溶液(1 mol/L)作為保護劑，無水乙醇和氫氧化鉀(50%)作為皂化堿液，混合物水浴皂化后冷卻至室溫。將上清液加入15 mL去離子水、15 mL乙醇，用25 mL正己烷提取3次，合并有機相。去離子水洗至中性。有機相旋蒸至干，殘渣用2 mL甲醇溶解，過0.45 μm尼龍膜，使用高效液相色譜測定VD2含量。

1.2.3 液相色譜分析條件

色譜柱：SinoChrom OD-BP(4.6×200 mm 5 μm)；流動相：甲醇-水；流動相比例：V(甲醇)∶V(水)=90∶10；流速： 1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：264 nm；進樣量：10 μL。

1.2.4 標準曲線的繪制

避光條件下準確稱取VD2標準品10 mg，甲醇溶液溶解并定容于棕色容量瓶100 mL，該儲備液濃度為100 μg/mL，-20 ℃下避光密封保存。準確吸取標準儲備液0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻。配制成濃度為1、5、10、20、40 μg/mL的標準系列工作液，上液相色譜測定，得到峰面積(y)和濃度(x)的線性回歸方程。

1.2.5 單因素實驗設計

1.2.5.1 醇堿體積比

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設置無水乙醇和氫氧化鉀(50%)的體積比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，液固比12∶1(mL∶g)，皂化時間60 min，皂化溫度70 ℃的條件下進行VD2的提取，考察醇堿體積比對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個處理設置3組平行實驗。

1.2.5.2 液固比

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設置液固比(mL∶g)為3∶1、6∶1、12∶1、18∶1、24∶1，在醇堿體積比為2∶1，皂化時間60 min，皂化溫度70 ℃的條件下進行VD2的提取，考察皂化堿液體積對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個處理設置3組平行實驗。

1.2.5.3 皂化溫度

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設置皂化溫度為50、60、70、80、90 ℃，在醇堿體積比為2∶1，液固比為12∶1(mL∶g)，皂化時間為60 min的條件下進行VD2的提取，考察皂化溫度對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個處理設置3組平行實驗。

1.2.5.4 皂化時間

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設置皂化時間為20、40、60、80、100 min，在醇堿體積比為2∶1，液固比為12∶1(mL∶g)，皂化溫度為70 ℃的條件下進行VD2的提取，考察皂化時間對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個處理設置3組平行實驗。

1.2.6 響應面實驗設計

根據單因素實驗優化結果，固定醇堿體積比為2∶1，選擇液固比(X1)、皂化溫度(X2)、皂化時間(X3)為考察因素，以VD2的提取量為響應值(Y，μg/g)，利用Design-Expert軟件設計3因素3水平的響應面實驗，如表1。

2 結果與分析

2.1 VD2標準曲線與色譜圖

VD2標準品及雙孢菇樣品色譜圖如圖1、圖2所示，根據標準品保留時間定性，峰面積定量。VD2質量濃度(x)和峰面積(y)之間的線性回歸方程為y=30 702x-1 809.2，R2>0.999，線性范圍1.0～40.0 μg/mL，VD2濃度和峰面積之間有良好的線性關系。

圖1 VD2標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of VD2

圖2 雙孢菇樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of white button mushroom sample

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 醇堿體積比

如圖3所示，當醇堿體積比從1∶1增加到2∶1后，VD2提取量有大幅度的增加，無水乙醇的增加使物料與皂化液混合更均勻。繼續增加醇堿體積比，VD2提取量略有減少并趨于穩定，過量無水乙醇的加入降低了KOH溶液的濃度，減少了VD2提取量，并增加了成本，故醇堿的體積比選擇2∶1。

圖3 醇堿體積比對VD2提取量的影響Fig.3 Effect of alcohol-alkali ratio on the extraction of VD2注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2.2 液固比

由圖4可以看出，液固比(mL∶g)在3∶1～12∶1，VD2提取量隨液固比的增加出現較大幅度的增加，液固比為12∶1(mL∶g)時，VD2提取量達到最大值，之后再增加液固比，對VD2提取量影響不大，曲線保持平穩趨勢。

圖4 液固比對VD2提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of VD2

堿液的增加使物料皂化更充分，但后續過程需要大量的水洗去殘留堿液，對VD2造成一定的損失，綜合考慮，液固比選擇12∶1(mL∶g)。

2.2.3 皂化溫度

如圖5所示，隨著溫度的升高，VD2提取量先增加后減少。皂化反應為吸熱反應，溫度的升高加快了反應速率，增加了VD2提取量，但當溫度超過70 ℃時，由于高溫破壞了VD2結構，導致提取量減少，故皂化溫度選擇70 ℃。

圖5 皂化溫度對VD2提取量的影響Fig.5 Effect of saponification temperature on the extraction of VD2

2.2.4 皂化時間

由圖6可知，皂化時間在20～60 min，皂化時間對VD2提取量影響程度較大，皂化時間的延長使皂化反應更加完全，當皂化時間達到60 min時，VD2的提取量達到最大值。繼續延長皂化時間，VD2提取量趨于穩定，故皂化時間選擇60 min。

圖6 皂化時間對VD2提取量的影響Fig.6 Effect of saponification time on the extraction of VD2

2.3 響應面實驗結果分析

基于單因素實驗結果，以液固比(X1)、皂化溫度(X2)、皂化時間(X3)為自變量，VD2提取量(Y)為響應值，對雙孢菇中VD2皂化反應工藝進行響應面實驗優化，結果見表2。

2.3.1 模擬方程的建立及顯著性檢驗

利用統計軟件Design-Expert軟件對表2的實驗結果進行多元回歸擬合，得到3個自變量與提取量之間的二次多項回歸方程：

表2 皂化反應工藝響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental results of response surface analysis for optimizing the saponification of VD2

對回歸模型進行方差分析以檢驗其顯著性，如表3所示。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：*表示差異顯著，P<0.05,**表示差異極顯著，P<0.01。

各因素的顯著性檢驗結果表明所選擇的3個因素對VD2皂化反應的影響程度：皂化溫度(X2)>液固比(X1)>皂化時間(X3)。3個因素的二次項對VD2皂化反應的影響均為顯著，X1X2對VD2皂化反應影響效果較顯著，X1X3、X2X3對VD2皂化反應影響效果不顯著。

2.3.2 響應面分析影響因素的交互作用

3因素交互作用的響應面和等高線圖如圖7所示，由圖7可以直觀地看出因素間兩兩交互作用對響應值的影響。液固比和皂化溫度的交互作用對VD2的提取量影響較顯著，表現為響應面坡度較陡、等高線橢圓明顯。液固比和皂化時間的交互作用對VD2的提取量影響程度次之，皂化溫度和皂化時間的交互作用對VD2提取量的影響不顯著，表現為響應面曲面較為平滑。

圖7 各因素交互作用對VD2提取量影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of various factors on the extraction of VD2

通過響應面實驗分析得到的VD2最佳皂化工藝參數為液固比為12.36∶1(mL∶g)、皂化溫度為74.7 ℃、皂化時間為62.6 min，此條件下，VD2的理論提取量為8.25 μg/g。 為檢驗該模型所得最佳工藝參數的可行性，采用上述工藝參數進行驗證實驗，考慮到實際操作，調整最佳工藝為液固比為12∶1(mL∶g)、皂化溫度為75 ℃、皂化時間為63 min，3組平行實驗得到VD2的平均提取量為8.13 μg/g，與理論值誤差較小，證明響應面實驗所得皂化工藝條件可信可行。

3 結論

由季節、地理、飲食習慣等原因導致的VD缺乏情況在世界范圍內較為普遍[14]，不同人群的VD的每日參考攝入量范圍為15～20 μg[16，27]，以本文的量來計算，大約25 g紫外線處理后的新鮮食用菌即可滿足需求。

以紫外線處理后的雙孢菇為實驗材料，結合單因素實驗結果，對VD2的皂化工藝進行了響應面實驗，優化得到的最佳工藝參數為液固比為12∶1(mL∶g)、皂化溫度為75 ℃、皂化時間為63 min，驗證實驗得到VD2的平均提取量為8.13 μg/g，與理論值偏差較小，說明響應面法分析得到的最佳工藝參數合理可行，為食用菌中VD2的精準分析提供參考，從而最終為富含VD2的食用菌產品開發利用提供參考。