采用高靈敏共振光散射技術檢測食品中殘留的卡馬西平

江虹，龐向東，吳小燕，程丹，李娜

(長江師范學院 化學化工學院，長江師范學院武陵山片區綠色發展協同創新中心，重慶，408100)

食品中的藥殘分析，對保障人體健康、及時采取防病防毒措施具有重意義。我國農業部在176 號公告中規定，嚴禁在動物飼料和飲用水中添加鎮靜、抗驚厥藥物，在動物源食品中也不得檢出此類藥物[1]?？R西平屬二苯并氮雜類抗癲癇、鎮痛藥物，具有抑制神經興奮、減少機體運動和安眠鎮靜等作用。當用藥過量時，年老者可引起精神錯亂、激動不安、焦慮、房室傳導阻滯或心動過緩等(卡馬西平使用說明書中特別強調)；由于卡馬西平能透過胎盤屏障，通過乳汁進行分泌，因此對妊娠孕婦及哺乳期婦女均有影響。畜牧業中，為了對所飼養的畜禽達到快速增重、催肥、謀取更多經濟利益的目的，飼養過程中，有的飼養者擅自在動物飼料或飲水中加入了卡馬西平等鎮靜藥物，導致此類藥物在動物源食品中的殘留，從而對消費者人體健康造成一定危害。由此可見，對動物源性食品中殘留的卡馬西平進行研究具有一定的必要性和重要性。目前，國內外測定卡馬西平的方法主要有高效液相色譜法[2-8],液質聯用[9-11],熒光法[12-13],分光光度法[14-15],電化學法[16-17]等。這些方法中，有的所用儀器價格較貴，不易普及，有的選擇性不好或靈敏度不高，有的條件要求苛刻等。本工作是在用吸收光譜法研究卡馬西平之后，發現用共振光散射(resonance light scattering,RLS)技術研究肉食品中殘留的卡馬西平，有更高的靈敏度，比吸收光譜法約高4～5個數量級，并且有很好的選擇性。該方法用于肉食中殘留卡馬西平的測定，結果滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡馬西平(CMA)(99.7%，對照品批號：100142-201105)，中國食品藥品檢定研究院；考馬斯亮藍(CMS)(分析純)，臨海市億達貿易有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris，99.9%)，齊一生物科技(上海)有限公司；溴代十六烷基吡啶(CPB，99%)，武漢易泰科技有限公司上海分公司；豬肉(1#～2#)、雞肉(3#～4#)， 市售；水，二次蒸留水。

卡馬西平標準溶液：準確稱取CMA對照品適量，加少量甲醇溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用水定容，配成236.3 mg/L貯備液，冰箱4 ℃ 保存；臨用時取貯備液稀釋100倍?？捡R斯亮藍溶液：1.00×10-4mol/L。溴代十六烷基吡啶溶液：稱取適量的CPB，加少量無水乙醇溶解后用水稀釋配成5.00×102mg/L。pH 3.0～8.5 Tris-鹽酸溶液：適量0.10 mol/L鹽酸與適量0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計測定而配成。

1.2 儀器與設備

F-2500型熒光光度計，日本日立公司；pHS-3C 型精密酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 樣品處理

取生鮮豬肉和雞肉洗凈、切條并攪成肉末。準確稱取各樣品15 g左右(精確至0.000 1 g)，置于離心試管中，加甲醇10 mL，攪勻，超聲提取40 min，再離心分離(4 000 r/min)20 min，分出上清液。按上述操作再重復提取1次。2次上清液合并后，加入20 mL甲醇，超聲提取30 min，再離心分離(4 000 r/min)30 min，上清液轉入一小燒杯中，在通風櫥內100 ℃恒溫水浴濃縮至約3 mL即為待測樣品溶液(各平行處理5份)。

1.4 實驗方法

在10 mL具塞比色管中，順序加入適量2.363 mg/L CMA標準溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L CMS溶液、0.30 mL 5.00×102mg/L CPB溶液和 0.50 mL pH 3.46 Tris-鹽酸溶液，用二次蒸餾水定容、搖勻，15 min后，于熒光儀上(設λex=λem=220 nm，測定狹縫5 nm)同步掃描RLS光譜，記錄344 nm波長處體系和試劑空白的RLS強度IRLS及I0，并計算他們的強度差值ΔIRLS=IRLS-I0。

2 結果與討論

2.1 CMA-CPB-CMS的RLS光譜

按1.4的方法掃描體系各不同組合的RLS光譜，見圖1。

1-0.236 mg/L CMA；2-2.50×10-5 mol/L CMS；3-15.0 mg/L CPB；4-2.50 ×10-5 mol/L CMS,pH 3.46；5-15.0 mg/L CPB,pH 3.46；6-0.236 mg/L CMA-2.50×10-5 mol/L CMS,pH 3.46；7～12-0.0、0.047 3、0.094 5、0.142、0.189、0.236 mg/L CMA-2.50×10-5 mol/L CMS-15.0 mg/L CPB,pH 3.46圖1 CMA-CMS-CPB 的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of CMA-CMS-CPB

從曲線1～6可知，單獨的CMA、CMS、CPB溶液的RLS信號十分微弱，CMS的酸性溶液(pH 3.46)、CPB的酸性溶液(pH 3.46)及CMS與CMA在酸性溶液(pH 3.46)中反應后的RLS信號也很微弱。但當CMS與CPB在酸性溶液(pH 3.46)中共存時，RLS信號有顯著增強，見曲線7，這說明CPB可以增敏CMS；當CMA、CMS、及CPB三物質在酸性溶液(pH 3.46)中共存時，體系RLS信號隨著CMA質量濃度的增加而增強，當CMA處于一定濃度范圍內，體系的ΔIRLS與CMA的質量濃度呈線性關系，可用于卡馬西平的定量測定。

可能的反應機理：從CMA、CPB及CMS的分子結構式(圖2)可見，CMA上的氮原子可接受質子，以陽離子形式存在于溶液中；CPB分子結構上的Br-離去后以陽離子預膠束聚集體形式存在于溶液中；CMS分子結構上的Na+離去后以陰離子形式存在于溶液中。

圖2 結構式Fig.2 Structural formula

帶負電荷的CMS可聚集在帶正電荷的CPB聚集體的表面，導致RLS信號急劇增強?？梢?，CMS不僅可與CMA反應還可與CPB反應，即體系中存在競爭反應。他們的可能反應為：帶負電荷的CMS先與帶正電荷的CPB以靜電引力結合生成帶負電荷的締合顆粒，再與帶正電荷的CMA結合(靜電引力)生成電中性的三元離子締合物；或CMS先與CMA以靜電引力結合生成帶負電荷的締合顆粒，再與CPB結合(仍為靜電引力)生成電中性的三元離子締合物。無論以哪種方式結合，最終生成的三元離子締合物有其較大的摩爾質量，導致RLS顯著增強。

2.2 反應條件

2.2.1 介質及酸度

按1.4的實驗方法分別考察了不同濃度的HCl、NaOH及不同pH的Tris-鹽酸作介質時對體系ΔIRLS的影響。結果顯示，用pH 3.46 Tris-鹽酸作反應介質時體系有較大的ΔIRLS(見圖3誤差線圖)，且有較好的重現性。

圖3 pH值的影響Fig.3 Effect of buffer pH on ΔIRLS

而用不同濃度的鹽酸或NaOH作反應介質時，其體系的IRLS和試劑空白的I0均較小，ΔIRLS

2.2.2 CMS溶液的濃度

按1.4的實驗方法，考察了不同用量的1.00×10-4mol/L CMS溶液對體系ΔIRLS的影響。結果顯示，CMS溶液的濃度在2.2×10-5～ 2.8×10-5mol/L，體系有較大ΔIRLS(見圖4誤差線圖)。

圖4 考馬斯亮藍濃度對體系ΔIRLS的影響Fig.4 Effect of coomassie brilliant blue concentration on ΔIRLS

在此范圍外，ΔIRLS均有不同程度的降低，靈敏度隨之降低。降低原因：當CMS的濃度小于2.2×10-5mol/L時，CMA、CMS及CPB間的反應不完全，使ΔIRLS有所降低；當CMS的濃度大于2.8×10-5mol/L時，由于CMS分子間的聚集，使ΔIRLS降低。故實驗選用CMS溶液的濃度為2.50×10-5mol/L(即取2.50 mL 1.00×10-4mol/L CMS溶液于10 mL比色管中)。

2.2.3 表面活性劑及用量

按1.4的實驗方法，考察了陰離子表面活性劑(十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉)、陽離子表面活性劑(溴代十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基銨) 及非離子表面活性劑(Tween-20、Triton X-100) 等對體系ΔIRLS的影響。結果顯示，在濃度和用量相同的情況下，使用溴代十六烷基吡啶(CPB)作增敏劑有較好的效果，其ΔIRLS相對較高(ΔIRLS=205)。當5.00×102mg/L CPB的用量為0.30 mL時，體系的RLS信號相對最強，此時的ΔIRLS=225，體系有較高靈敏度，如圖5所示。故實驗用0.30 mL 5.00×102mg/L CPB溶液。

圖5 CPB 溶液用量的影響Fig.5 Effect of CPB solution dosage on ΔIRLS

2.2.4 試劑加入順序

考察了反應體系中各試劑加入順序對體系ΔIRLS的影響。結果顯示，試劑加入的最佳順序為CMA、CMS、CPB、Tris-鹽酸。按此順序加入時，體系的RLS信號相對最強，ΔIRLS較大，靈敏度較高。故實驗按試劑的最佳加入順序進行。

2.2.5 反應時間及穩定性

按1.4的實驗方法，考察了反應時間對體系ΔIRLS的影響，如圖6所示。

圖6 時間對ΔIRLS的影響Fig.6 Effect of time on ΔIRLS

結果顯示，該體系在15 min內即可反應完全。15 min前，隨著反應的進行，體系的ΔIRLS隨時間增加而逐漸增大，曲線表現為一條逐漸上升的斜線，由此表明此時CMA、CMS及CPB間的反應并未完全；15 min后，體系的ΔIRLS隨時間的增加不再增大，即ΔIRLS基本處于同一平臺上，由此表明此時CMA、CMS及CPB間的反應已進行完全。故實驗選在15 min后進行測定，穩定時間的1.5 h。

2.3 工作曲線及相關參數

按1.4的實驗方法，配制CMA標準系列溶液，掃描RLS光譜，以ΔIRLS為縱坐標，CMA的質量濃度ρ(mg/L)為橫坐標，繪制344 nm波長處CMA的工作曲線，見圖7。

圖7 CAM 的工作曲線Fig.7 Working curve of carbamazepine

該工作曲線的線性回歸方程為ΔIRLS=-0.194 2+951.0ρ，相關系數r=0.999 1，CMA在0.006～0.33 mg/L與ΔIRLS呈線性關系，檢出限(3Sb/S)為0.005 6 mg/L，定量限為0.012 mg/kg。

2.4 共存物質的影響

考察了相對誤差≤±5% 時，某些可能存在的干擾物質對測定0.236 mg/L CMA的影響，結果見表1。結果顯示，氨基酸、糖類及常見陰、陽離子均不干擾測定，故該法有很好的選擇性。

表1 共存物質的影響Table 1 Effect of coexistent substance

2.5 樣品分析

取1#～4# 待測液，按1.4實驗方法，以樣液代替標液，掃描RLS光譜。實驗結果表明，在344 nm處，均未檢出卡馬西平。為了考察該方法的準確度和精密度，以空白肉樣為樣品，分別進行3個不同加標梯度(即不同水平)的回收試驗，每個加標水平平行測定5份，最后根據回收率和相對標準偏差判斷該方法的準確度和精密度，結果見表2。

3 結論

在pH 3.46 Tris-鹽酸及CPB存在下，以CMS作探針測定肉食品中痕量CMA的RLS法具有高的靈敏度和選擇性、較高的準確度和精密度及較寬的線性范圍。該法簡便、快速，操作簡單，所用儀器為一般的熒光分光光度計，易于普及。適于肉食品中殘留CMA的測定。