乳及乳制品中常見“活的非可培養(yǎng)態(tài)”食源致病菌研究進(jìn)展

張竟豐，王 麗，陳 洵，謝 會(huì)，曹 瀟，趙力超,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.暨南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632；3.廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510006）

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的增長和居民飲食健康意識的提升，乳及乳制品作為膳食結(jié)構(gòu)中重要的一環(huán)，其消費(fèi)需求也日益增大。根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，我國城鎮(zhèn)居民家庭人均鮮奶購買量從1996年的4.6 kg逐年上升到2006年的18.3 kg，自2007年起有所下降，之后一直維持在14 kg左右[1]。然而，我國乳及乳制品的安全問題不容樂觀，其主要集中在抗生素殘留、食品添加劑濫用、微生物污染等方面，其中微生物污染問題是最主要的。國家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于2017年1ü11月嬰幼兒配方乳粉抽檢情況顯示，不合格項(xiàng)目主要集中在標(biāo)簽問題和微生物污染，其中共檢出阪崎腸桿菌2 批次。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)[2]，在2011ü2017年5月近6 年間美國共發(fā)生13 起由單核增生李斯特氏菌引起的食物安全事件，其中有8 起與乳制品有關(guān)。此外，由乳及乳制品中沙門氏菌[3]、金黃色葡萄球菌[4-5]、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）[6]、大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）[8]、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）[9]等致病菌引起的中毒事件在國內(nèi)外也屢有報(bào)道。乳及乳制品中微生物污染問題成因較為復(fù)雜。首先，污染途徑廣是導(dǎo)致其微生物污染的重要原因。引起乳制品微生物污染的環(huán)節(jié)很多[10]，其中原料乳本身攜帶較多的微生物，在擠乳、貯運(yùn)過程中易造成源頭污染，而且加工過程中添加劑的使用、生產(chǎn)環(huán)境、運(yùn)輸條件等因素都可能造成微生物的后期污染；其次，乳及乳制品中“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”（viable but nonculturable state，VBNC）致病菌的發(fā)現(xiàn)使得微生物安全問題愈加不容忽視。大量的研究表明，乳及乳制品的生產(chǎn)、加工和貯運(yùn)條件（如不銹鋼管道運(yùn)輸、巴氏殺菌等）能夠使各種致病菌產(chǎn)生脅迫適應(yīng)能力，進(jìn)入VBNC，而致病菌一旦進(jìn)入VBNC，無法通過傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法檢測，但仍具有可測量的代謝活性，能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而產(chǎn)生毒力和致病性，對公共安全造成嚴(yán)重威脅[11-13]。

現(xiàn)行有效的GB 4789.18ü2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳與乳制品檢驗(yàn)》中常規(guī)平板計(jì)數(shù)法仍廣泛應(yīng)用于乳及乳制品中各類病原微生物的檢測，可以檢出大多數(shù)活的可培養(yǎng)的食源性致病菌。然而，針對VBNC致病菌的檢測，其在平板上無法培養(yǎng)，但仍具有可測量的代謝活性，在合適的條件下可以快速復(fù)蘇為可培養(yǎng)的細(xì)胞，產(chǎn)生毒力，從而避開傳統(tǒng)的檢測方法。目前VBNC致病菌的檢測方法報(bào)道較多的有：吖啶橙染色熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、基于DNA分子的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、基于mRNA分子的反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)[14-16]。然而，熒光顯微鏡觀察常用于定性分析VBNC致病菌，在定量方面存在隨機(jī)誤差大等局限；至于基于DNA分子的檢測技術(shù)，死菌DNA的存在使得檢測結(jié)果高估了樣品中的活菌水平；基于mRNA分子的檢測技術(shù)則存在mRNA提取量少、代謝活躍容易發(fā)生降解等問題，而通過復(fù)蘇致病菌再進(jìn)行檢測的方法也不可行，因?yàn)閺?fù)蘇耗時(shí)較長，往往需要幾個(gè)月甚至更長的時(shí)間。因此，VBNC致病菌檢測往往還需要結(jié)合其他的前處理手段，如利用乙錠單疊氮化合物（ethidium monoazide bromide，EMA）或疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）染料，基于細(xì)胞的膜完整性對死、活細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分檢測[15]；也有報(bào)道采用基于細(xì)胞酯酶代謝活性的疊氮噻唑橙熒光染料（thiazole orange monoazide，TOMA）[17]，能夠更為精確地區(qū)分死、活細(xì)胞；此外，對于基質(zhì)復(fù)雜的待測樣品，有研究采用基于抗原抗體反應(yīng)的免疫磁珠或者基于對細(xì)胞壁組分保留親和力的溶菌酶進(jìn)行特異性富集[18-19]。目前對于VBNC致病菌的檢測尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)檢測體系尚未完善。

綜上所述，乳及乳制品中微生物污染問題不容忽視，尤其食源致病菌VBNC的發(fā)現(xiàn)大大增加了檢測的難度。因此，本文綜述了乳及乳制品中幾種常見VBNC食源致病菌細(xì)菌的研究進(jìn)展，包括致病菌的誘導(dǎo)和復(fù)蘇因素、生物學(xué)特性及其檢測方法，旨在提高人們對乳及乳制品中食源VBNC細(xì)菌研究的重視程度，尤其是關(guān)注致病菌VBNC的相關(guān)研究，以期為其檢測方法的更新提供參考，也為完善乳及乳制品中常見致病菌的檢測體系提供理論依據(jù)。

1 VBNC細(xì)菌研究進(jìn)展

1.1 VBNC細(xì)菌研究概述

早在20世紀(jì)50年代末，海洋微生物學(xué)領(lǐng)域的工作者就報(bào)道了由顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法測得的細(xì)菌數(shù)量之間存在的顯著性差異[20]。盡管存在細(xì)胞聚集現(xiàn)象和非生物顆粒的干擾，但這項(xiàng)研究也表明了基于細(xì)菌可培養(yǎng)性的平板計(jì)數(shù)法可能低估了樣本中活細(xì)胞數(shù)量。1982年，Xu Haishu等[21]首次正式報(bào)道了大腸桿菌和霍亂弧菌存在VBNC這一現(xiàn)象，即存在“不可恢復(fù)”但仍保持活性的狀態(tài)。到目前為止，研究人員已經(jīng)確認(rèn)了自然界有85 種細(xì)菌能夠進(jìn)入VBNC，其中包括18 種非致病菌和67 種致病菌。這18 種非致病菌普遍在發(fā)酵飲料中被發(fā)現(xiàn)，而另外67 種致病菌中目前已知有16 種對人類健康無害，但能感染其他生物體，如植物[22]。關(guān)于細(xì)菌VBNC的定義，目前主流的觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)菌受環(huán)境脅迫后，逐漸喪失在常規(guī)培養(yǎng)基上的“可培養(yǎng)性”，但仍保持活性的狀態(tài)，即細(xì)菌的VBNC[23-24]。細(xì)菌VBNC的研究對于食品安全包括乳制品微生物污染問題具有重要意義。首先，VBNC可以看作是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境脅迫的一種普遍生存策略[25]，其中被報(bào)道能進(jìn)入VBNC的細(xì)菌，囊括34 個(gè)屬，涵蓋擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門。自然界中各種脅迫因素?zé)o處不在，如低溫、寡營養(yǎng)、紫外線、化學(xué)物質(zhì)等均可能導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[26]，且細(xì)菌在環(huán)境脅迫下具有自適應(yīng)能力，能夠調(diào)整或改變代謝途徑，進(jìn)入VBNC，從而避免特定脅迫因素引起的代謝或結(jié)構(gòu)破壞[27]。其次，雖然VBNC細(xì)菌通常無法引發(fā)疾病，但致病菌的毒性可以在復(fù)蘇后恢復(fù)，進(jìn)而感染人群、引起疾病[28-29]。

1.2 VBNC細(xì)菌的生理學(xué)特性

自然界中，與VBNC相似的細(xì)菌存活狀態(tài)包括休眠、芽孢等。目前，VBNC僅存在于非芽孢細(xì)菌的觀點(diǎn)被廣泛接受，而休眠態(tài)與VBNC的關(guān)系尚存在爭議。Mukamolova等[30]認(rèn)為VBNC與休眠狀態(tài)的區(qū)別就在于VBNC細(xì)胞表現(xiàn)出可測量的代謝活性，而在休眠細(xì)胞中無法檢測到。還有學(xué)者認(rèn)為VBNC是休眠態(tài)細(xì)胞的一種形式，因?yàn)閂BNC細(xì)胞與休眠態(tài)細(xì)胞一樣，都具有不可培養(yǎng)的特性，且能夠在宿主體內(nèi)復(fù)蘇[31]。表1比較了幾種常見細(xì)胞狀態(tài)下的代謝活性、復(fù)蘇能力、細(xì)胞完整性和平板培養(yǎng)能力。

表1 不同狀態(tài)下細(xì)胞的部分生物學(xué)特性比較Table1 Comparison of biological characteristics of difference cells under different states

大多數(shù)進(jìn)入VBNC的細(xì)菌的體積、形態(tài)等都會(huì)發(fā)生變化。革蘭氏陰性菌在進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，形態(tài)一般由桿狀變?yōu)榍驙罨蚯驐U狀，體積變小，如大腸桿菌、副溶血性弧菌等[32-33]。但目前也有報(bào)道VBNC的大腸桿菌仍為短棒狀[34]。而革蘭氏陽性菌進(jìn)入VBNC后其形態(tài)變化較為復(fù)雜，如空腸彎曲桿菌在低溫環(huán)境下會(huì)呈螺旋狀或者保持原狀不變 。此外，復(fù)蘇后的VBNC大多與正常細(xì)菌形態(tài)類似[35]。

目前科學(xué)界已廣泛認(rèn)同VBNC致病菌對公眾健康具有潛在威脅，但關(guān)于VBNC狀態(tài)下致病菌的毒力及其致病性仍存在爭議。如牛乳中常見的腸出血性大腸桿菌O157:H7是重要的食源性致病菌之一，主要通過產(chǎn)生志賀毒素、溶血素和黏附素在腸道上皮細(xì)胞表面形成擦拭性損傷，引起腸炎等疾病，損害人體健康。趙鳳[36]的研究表明，VBNC大腸桿菌O157:H7仍然具備在宿主細(xì)胞上黏附的能力及引起擦試性損傷。空腸彎曲桿菌的毒力也通過類似的途徑表現(xiàn)，Patrone等[37]通過檢測VBNC空腸彎曲桿菌CadF蛋白的表達(dá)，證實(shí)其仍具備在腸道黏膜上的黏附能力。但也有研究表明，VBNC細(xì)菌不具有致病性，只有在其復(fù)蘇為正常細(xì)胞時(shí)，才能表現(xiàn)出毒力和致病性[26]。無論如何，VBNC致病菌作為微生物污染中重要的組成部分，在食品安全方面存在重大的隱患。

2 乳及乳制品中VBNC致病菌的誘導(dǎo)和復(fù)蘇

乳及乳制品中包含豐富的營養(yǎng)元素，可以充分滿足人體對于各類營養(yǎng)物質(zhì)的需求，與此同時(shí)也成為許多致病菌理想的培養(yǎng)基。乳制品中部分產(chǎn)品的酸性條件、巴氏殺菌工藝等環(huán)境條件能夠抑制致病菌增殖，但目前有越來越多的證據(jù)表明，乳及乳制品中的致病菌可以被誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC，能夠保留毒力并在合適的條件下復(fù)蘇。Gunasekera等[11]的研究表明，巴氏殺菌后的鮮乳中有明顯的細(xì)胞亞群處于VNBC，大量的細(xì)胞由于熱處理而不能形成菌落，但仍有可測量的代謝活性，能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯基因，具有致病性。Gahan等[38]研究了單核增生李斯特氏菌在普通奶酪、酸奶、低脂奶酪和全脂奶酪中的酸適應(yīng)能力，其中全脂奶酪和低脂奶酪中的單核增生李斯特氏菌突變體ATM56能夠在70 d后恢復(fù)活性，該研究結(jié)果也表明單核增生李斯特氏菌在乳制品中存在VBNC，且其誘導(dǎo)和復(fù)蘇因素也值得進(jìn)一步研究。

表2 乳及乳制品中幾種常見的VBNC食源致病菌誘導(dǎo)因素和復(fù)蘇方法Table2 Induction and resuscitation of common VBNC pathogens in milk and dairy products

在乳及乳制品加工、貯藏和運(yùn)輸?shù)倪^程中，存在著各種各樣的脅迫因素，如高溫、低溫、寡營養(yǎng)、極端pH值等。這些因素均可能導(dǎo)致其中的致病菌進(jìn)入VBNC，增大檢測難度；但同時(shí)，乳及乳制品中的VBNC致病菌通常只有在復(fù)蘇后才能表現(xiàn)出致病性，因此研究其復(fù)蘇因素同樣具有重要意義。表2總結(jié)了乳及乳制品中幾種常見的VBNC食源致病菌誘導(dǎo)因素和復(fù)蘇方法。

2.1 VBNC致病菌誘導(dǎo)

在乳及乳制品的生產(chǎn)、加工、貯藏過程中，有許多脅迫因素均可能導(dǎo)致致病菌進(jìn)入VBNC。Suliantari等[12]發(fā)現(xiàn)，在模擬奶粉生產(chǎn)加工的條件（1/10 TSA、不銹鋼管道輸送）下，阪崎腸桿菌被誘導(dǎo)進(jìn)入了VBNC。研究者用乳糖誘導(dǎo)型綠色熒光蛋白基因（gfp）標(biāo)記大腸桿菌，并在63.5 ℃下加熱牛乳30 min，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基于染料排除的活菌計(jì)數(shù)法測得的活細(xì)胞數(shù)顯著高于基于細(xì)菌可培養(yǎng)性的平板計(jì)數(shù)法測得的數(shù)量，結(jié)果表明巴氏殺菌后的牛乳中大腸桿菌處于VBNC[54]。姜琛璐等[57]研究了阪崎腸桿菌在奶粉沖調(diào)溫度下的存活率，結(jié)果表明部分阪崎腸桿菌菌株處于65 ℃以下的沖調(diào)溫度環(huán)境時(shí)能夠保持一定的活性，可能進(jìn)入VBNC。

此外，乳品加工過程中經(jīng)常會(huì)接觸到一些化學(xué)脅迫因素，如使用添加劑以延長其貨架期。然而添加劑作為一種脅迫因素，同時(shí)也可能誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC，從而避開傳統(tǒng)的檢測方法，對公共健康造成威脅。

劉德欣等[35]采用不同溫度和山梨酸鉀濃度誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌，使其進(jìn)入了VBNC。田娟等[58]采用食品防腐劑誘導(dǎo)副溶血性弧菌進(jìn)入了VBNC。

2.2 VBNC致病菌復(fù)蘇

細(xì)菌經(jīng)環(huán)境脅迫進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，喪失了在平板上的生長繁殖能力，但仍具有可測量的代謝活性，在適宜的條件下可以復(fù)蘇為正常的可培養(yǎng)細(xì)胞，這個(gè)過程是VBNC態(tài)致病菌可能開始大量繁殖并存在的基本條件。VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇是一個(gè)復(fù)雜的過程，其復(fù)蘇機(jī)制尚未明確。目前研究較多的是“探索因子”和“群體感應(yīng)”假說，其中隨機(jī)出現(xiàn)的探索因子和群體感應(yīng)中的活化細(xì)胞菌有助于解釋細(xì)菌VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇過程，兩者具有一定的內(nèi)在聯(lián)系[59-60]。目前已知的復(fù)蘇因素包括升溫、共培養(yǎng)、添加營養(yǎng)物（如酵母浸膏）、添加化學(xué)物質(zhì)（如丙酮酸鹽、Tween-80）、添加復(fù)蘇因子Rpf等。Ayrapetyan等[59]的研究表明，群體感應(yīng)的自體誘導(dǎo)物AI-2可以誘導(dǎo)VBNC創(chuàng)傷弧菌復(fù)蘇，而不能產(chǎn)生AI-2突變體的VBNC細(xì)胞在培養(yǎng)物中補(bǔ)充外源AI-2也能復(fù)蘇。Morishige等[61]在VBNC沙門氏菌中添加丙酮酸鈉后，使得細(xì)胞復(fù)蘇，同時(shí)相關(guān)研究也證明了丙酮酸鹽在復(fù)蘇過程中是觸發(fā)大分子合成（如DNA和蛋白質(zhì)）的關(guān)鍵分子之一。VBNC空腸彎曲桿菌與宿主細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后，同樣能夠復(fù)蘇形成菌落[62]。因此，乳及乳制品中致病菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，在加工、貯運(yùn)條件中仍然可能復(fù)蘇為正常細(xì)胞，產(chǎn)生毒力。

3 乳及乳制品中幾種常見VBNC致病菌的檢測方法及應(yīng)用前景

合理有效的細(xì)菌檢測方法對于乳及乳制品中食源致病菌檢測具有現(xiàn)實(shí)意義，對于那些只能應(yīng)用非傳統(tǒng)檢測方法的VBNC細(xì)菌而言，正確的選擇適合的檢驗(yàn)手段更是研究該類微生物的必要工作。表3列舉了多種檢驗(yàn)VBNC致病細(xì)菌的手段，主要包括光學(xué)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和生物傳感器技術(shù)。

表3 乳及乳制品中幾種常見VBNC致病菌檢測方法Table3 Detection methods for common VBNC pathogenic bacteria in milk and dairy products

過去科學(xué)家常用熒光染色方法來觀察VBNC細(xì)胞，如活菌直接計(jì)數(shù)法、活/死菌試劑盒法，此類方法常用于定性判斷。目前應(yīng)用分子生物學(xué)和傳感器方法對VBNC細(xì)胞進(jìn)行定性、定量分析的報(bào)道越來越多。傳統(tǒng)PCR和基于mRNA的實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR等方法敏感、快速，在實(shí)驗(yàn)室檢測中應(yīng)用最為廣泛。最新的生物傳感器結(jié)合了分子檢測與傳感系統(tǒng)，能夠產(chǎn)生可測定的光電信號，與傳統(tǒng)方法相比具有檢測迅速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在VBNC致病菌的檢測方面具有很好的應(yīng)用前景。Labib等[76]開發(fā)了一種基于核酸適配體的傳感器檢測方法，用于檢測VBNC沙門氏菌，能夠在30 mL的樣品中檢測到30 個(gè)活細(xì)胞。Said等[75]開發(fā)了基于噬菌體的傳染率的生物傳感器用以檢VBNC細(xì)菌。Liu Haibin等[73]開發(fā)了一種新的以表面增強(qiáng)拉曼散射為基礎(chǔ)的橫向流帶狀生物傳感器，結(jié)合RPA用于同時(shí)檢測單核增生李斯特氏菌和腸炎沙門氏菌，兩種致病菌的檢測限分別為27 CFU/mL和19 CFU/mL。

在乳制品檢測中，傳統(tǒng)的國標(biāo)檢測方法（如分離培養(yǎng)、生化鑒定）無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測，存在特異性差、操作繁瑣、耗時(shí)等缺點(diǎn)，無法實(shí)現(xiàn)及時(shí)有效的檢測。對于乳制品中VBNC態(tài)的致病菌，光學(xué)方法和免疫學(xué)方法都容易出現(xiàn)漏檢，且免疫學(xué)方法中酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)影響因素較多，結(jié)構(gòu)類似物也會(huì)引起不同程度的交叉反應(yīng)，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。而PCR方法與傳感器方法成本較高，不適于大規(guī)模推廣。LAMP技術(shù)、RPA技術(shù)在檢測VBNC菌方面具有較好的特異性和靈敏性，而且只需要簡單恒溫設(shè)備就能進(jìn)行LAMP反應(yīng)，成本較低。由于死菌和食品基質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪等的干擾，單一的LAMP和RPA檢測方法仍存在缺陷，目前的研究通常將活性染色、免疫磁珠富集、傳感器技術(shù)與分子生物學(xué)方法結(jié)合，這不僅提供了新的檢測思路，而且可以有效避免單一方法的不足，進(jìn)而提高對食源性致病菌VBNC狀態(tài)檢測的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 語

乳及乳制品中VBNC細(xì)菌的污染問題不容忽視，容易成為逃避檢測的“隱性傳染源”，對食品安全構(gòu)成潛在威脅。本文通過綜述乳及乳制品中幾種常見VBNC食源致病菌的誘導(dǎo)和復(fù)蘇因素、生物學(xué)特性及其檢測方法，為乳及乳制品微生物安全領(lǐng)域提供了新的研究對象及思路。同時(shí)由于乳制品中高脂肪、高蛋白的食品基質(zhì)干擾以及細(xì)菌VBNC的特殊性，對現(xiàn)有的快速檢測技術(shù)也提出了更高要求，通過對活性染色、免疫富集、生物傳感器等技術(shù)整合，有利于構(gòu)建新型微生物快速高通量檢測技術(shù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對食品中痕量食源致病細(xì)菌的快速定量檢測，進(jìn)一步保障乳及乳制品的質(zhì)量安全。