高壓微射流處理對米谷蛋白熱聚集體性質的影響

邢貝貝，張亭亭，趙 強*，熊 華

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

高壓微射流均質技術是一種新型的食品高壓加工技術，能對流體混合物料進行強烈的剪切、撞擊、高頻振蕩、壓力瞬間釋放、膨爆和氣穴等一系列綜合作用，從而起到很好的超微化、微乳化和均一化效果[1]。與傳統的高壓均質技術相比，高壓微射流在很大程度上更能對蛋白組分的結構和性質起到一定的改善作用，可以有效破壞分子間的疏水以及靜電相互作用，可改變蛋白分子的三、四級結構，盡管其對改變蛋白亞基結構沒有明顯效果[2-4]。

大米谷蛋白是大米蛋白中最主要的貯藏蛋白（所占比例66%～78%），由于疏水作用和亞基間—SH或üSüS—交聯，導致大米谷蛋白具有高度疏水性，加工性質不理想，因而限制了大米谷蛋白的應用。據文獻報道，大米谷蛋白的改性方法主要有高壓、脫酰胺、美拉德反應、酶解等物理、化學、生物酶法[5-8]。目前除了有少量酶法制備小分子蛋白水解物/肽實現了大米谷蛋白功能提升之外，開發大米谷蛋白資源并將其廣泛應用的問題，至今一直沒有得到很好的解決。

蛋白纖維化聚集體是蛋白在酸性加熱條件下形成的纖維狀蛋白聚集體結構[9]，聚集體的形成可以改變蛋白原有的結構及相關性質，如提高難溶蛋白的溶解性[10]。然而，大米谷蛋白纖維化聚集體的研究尚鮮見報道。作為一種熱聚集體，其功能性質的開發研究還有待進一步深入。因此，本研究嘗試聯合高壓微射流及酸法熱處理對大米谷蛋白進行改性，對表觀形貌、粒徑、ζ電位、表面疏水性、巰基含量、熱特性、二級結構組成、流變性能、乳化性能等指標進行分析，以期為高壓微射流技術處理蛋白熱聚集體的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米為市售；5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 北京索來寶化學試劑公司；三羥甲基胺基甲烷（Tris）、甘氨酸、尿素、巰基乙醇、正己烷、鹽酸、氫氧化鈉等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T18高速分散機 德國IKA公司；M-110EH微射流均質機 美國MFIC公司；Nano-ZSE激光粒度電位儀 英國Malvern公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；5700傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 美國Thermo Nicolet公司；DHR-2型流變儀 美國TA公司；Quanta 200F掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 大米谷蛋白的制備

大米谷蛋白的提取分離參考Zhao Qiang等[11]的方法。稱取粉碎過篩的秈米原料150 g，加入到1.5 L氫氧化鈉溶液（0.05 mol/L）中，常溫攪拌提取4 h后離心（5 000 r/min，30 min）取上清液，采用0.05 mol/L的鹽酸調pH值至4.8，靜置12 h后，離心取沉淀，適量去離子水洗滌3 次去除可溶物。接著，將沉淀物分散到1 L質量分數5% NaCl溶液中，常溫攪拌3.5 h，離心除去少量的清蛋白和球蛋白。然后，沉淀采用體積分數75%乙醇溶液1 L提取3.5 h后離心除去醇溶蛋白。最后，將沉淀物分散于適量去離子水中，調pH值至7.0，透析48 h，不間斷多次換水，冷凍干燥得到樣品（NRG）。

1.3.2 大米谷蛋白纖維化聚集體的制備

稱取一定量NRG溶于5 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 2.0）中，配制質量濃度1 g/100 mL的蛋白溶液，室溫攪拌2 h后密封于帶蓋瓶中，置于水浴搖床進行加熱處理（90 ℃，30 min）。熱處理后將樣品（HRG）迅速冰浴冷卻備用。

1.3.3 動態超高壓微射流處理

量取180 mL HRG樣品，經設定好微射流（壓力35、70、105、140 MPa）各均質一次。將樣品浸入冰水浴中以除去微射流處理產生的熱量。在各壓力下所得到的樣品分別為HRG-35、HRG-70、HRG-105、HRG-140，4 ℃下貯存備用。

1.3.4 表面形貌的觀察

采用掃描電子顯微鏡對NRG、HRG及其高壓處理后樣品的表面形貌進行觀察。將樣品均勻平攤在貼有導電膠的樣品臺上，噴金處理，觀察成像時加速電壓20 kV。

1.3.5 粒度分析

配制大米谷蛋白聚集物溶液并稀釋到蛋白質量濃度為1 mg/mL，經過0.45 μm的濾膜過濾后進行粒徑測定。樣品置于1 cmh1 cm的樣品池中，粒徑測試采用Nano-ZSE激光粒度電位儀，設置的基本測定條件為：溫度25 ℃；黏度0.887 2 cP；定角173°。

1.3.6 電位分析

采用激光粒度電位儀測定蛋白溶液的ζ電位。測定條件如下：比色池規格為1 cm聚硝乙甲池，采用一對0.45 cm2鉑電極，間距為0.4 cm。測定溫度25 ℃，溫度平衡時間2 min。每組測量10～50 次，依數據重現性而定。每次測定進行3 次，結果取3 次的平均值。

1.3.7 巰基含量的測定

蛋白質樣品巰基（包括暴露巰基和總巰基）含量的測定采用Ellman法，參考Zhao Qiang等[12]的操作，并稍作修改。具體過程如下：將每個樣品用去離子水稀釋至1 g/100 mL。為了測定暴露巰基含量，將0.5 mL 1 g/100 mL蛋白質溶液加入到2.5 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L EDTA，pH 8.0）中，并用含有8 μmol/L尿素的上述緩沖液測定總巰基含量。然后向緩沖液中加入0.02 mL Ellman’s試劑（4 mg/mL DTNB加入Tris-甘氨酸緩沖液中）。接著將溶液在室溫下孵育15 min，并通過紫外-可見分光光度計在412 nm波長處測定吸光度。巰基含量以每克蛋白所含巰基的物質的量表示，按式（1）計算。

式中：A412nm為412 nm波長處的吸光度；ρ為大米谷蛋白溶液質量濃度/（mg/mL）；D為稀釋因子。

1.3.8 表面疏水性的測定

使用8 mmol/L 1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（溶于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）作為熒光探針。使用相同的緩沖液將每個樣品稀釋至0.002 5、0.00 5、0.01、0.015、0.02 g/100 mL 5 個質量濃度。將20 μL 1-苯胺基-8-萘磺酸鹽溶液加入到4 mL各質量濃度樣品溶液中。使用分光熒光光度計，測定熒光強度（激發波長和發射波長分別為365 nm和484 nm）。以系列稀釋樣品溶液的熒光強度-蛋白質量濃度圖的初始斜率表征溶液的表面疏水性指數（H0）。

1.3.9 差示掃描量熱法測定

將約10 mg的1 g/ mL樣品置于鋁盤中并精確稱質量，然后將鋁盤密封。溫度從20 ℃升至100 ℃，5 ℃/min。使用空盤作為參考。然后記錄每個樣品的峰值溫度（Tp）和焓變（ΔH）。

1.3.10 FTIR分析

將蛋白樣品與KBr經干燥處理后，稱取約5 mg樣品與200 mg KBr研磨均勻，然后壓片，測定FTIR。掃描范圍4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描次數32 次。譜圖采用Omnic 8.0軟件和Peakf i t 4.12軟件進行分析。

1.3.11 流變性能的測定

配制5 g/100 mL蛋白溶液，采用DHR-2型流變儀測定樣品表觀黏度，選用直徑為40 mm不銹鋼平板夾具，設置間隙為1 mm，溫度25 ℃，在1%應變條件下，測定剪切速率為0.1～1 000 s－1的黏度動態變化。保持剪切速率為1 000 s－1，持續60 s，檢測剪切應力對時間的變化。

1.3.12 乳化活性和乳化穩定性的測定

乳化活性及乳化穩定性采用比濁法測定[13-14]。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）測定方法：在圓底離心管中加入16 mL 0.1 g/100 mL的樣品溶液和4 mL大豆油，用勻漿機以12 000 r/min高速剪切1 min，立即從底部0.5 cm處移取乳狀液50 μL，加入5 mL 0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉溶液稀釋，漩渦振蕩混勻，在500 nm波長處測吸光度A0，10 min后再次移取50 μL乳狀液，用十二烷基硫酸鈉溶液稀釋后測定其吸光度A10。其計算如式（2）、（3）所示。

式中：ρ為樣品溶液質量濃度（0.001 g/mL）；φ為油相所占體積分數（20%）；D為稀釋倍數；t為時間（10 min）。

1.4 數據統計與分析

采用Origin 8.5軟件對實驗數據進行統計分析，其中每組實驗或分析重復數為3 次，數據以平均值±標準差表示。顯著性分析采用ANOVA，并進行Tukey test法檢驗。

2 結果與分析

2.1 掃描電子顯微鏡分析

谷蛋白熱聚集體的微觀結構與其性質密切相關，利用掃描電子顯微鏡觀察了不同壓力處理下的米谷蛋白熱聚集體的微觀結構，如圖1所示。天然大米谷蛋白為片狀結構，在經過熱處理后有致密網絡狀結構生成，而經高壓微射流處理的米谷蛋白熱聚集體，觀察到明顯的網絡狀結構，且隨著壓力的增大，網狀結構由致密且排列有序的網狀結構變得松散且無序。

圖1 高壓微射流處理的大米谷蛋白聚集體的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopic analysis of rice glutelin aggregates treated by HPM

2.2 高壓處理對熱聚集谷蛋白粒徑的影響

米谷蛋白樣品的粒徑和蛋白質多分散系數如圖2所示。NRG的體積平均粒徑（101.11 nm）顯著小于HRG（146.93 nm）（P＜0.05），表明蛋白發生了熱聚集。在35 MPa和70 MPa的壓力處理下聚集體的粒徑進一步增大，分別為183.87 nm和184.77 nm，表明高壓使蛋白聚集體顆粒疏松且連續性更高（圖1），粒徑增大，這與高壓處理其他蛋白研究中對粒徑影響的結果[15-16]不一致；在更高的壓力（105 MPa和140 MPa）作用下，谷蛋白聚集體的粒徑減小，分別為155.03 nm和156.83 nm，說明蛋白質聚集體在某種程度上發生了解聚。在加熱期間，蛋白質經歷變性，隨后聚集，通過共價和非共價相互作用。微射流處理可顯著增大熱聚集的粒徑（P＜0.05），這可能主要歸因于高壓微射流的剪切作用破壞了米谷蛋白纖維化聚集體的非共價鍵。

圖2 高壓微射流處理對聚集體粒徑的影響Fig.2 Effect of HPM on particle size of aggregates

一般來說，多分散系數越小，說明分散體系中粒徑分布范圍越小，顆粒分散性越好。從圖2中可以看出，經高壓微射流處理的熱聚集谷蛋白多分散系數在0.25～0.32之間，較NRG的0.56和HRG的0.41小。隨著壓力的增大，多分散系數沒有明顯的變化，但都小于對照組，說明微射流處理改變了蛋白分散體系中顆粒粒徑的分散范圍，使粒徑分布范圍減小，蛋白質更容易分散在溶液中。

2.3 ζ電位變化

表1 高壓微射流處理對米谷蛋白聚集體ζ電位和表面疏水性的影響Table1 Effect of HPM on ζ potential and surface hydrophobicity of rice glutelin aggregates

顆粒的表面電荷不僅可以影響其穩定性，而且可以影響與其他顆粒的相互作用[17]。如多糖通常與蛋白質相互作用以形成可導致表面電荷變化的蛋白質-多糖配合物[18]。ζ電位可能受到許多因素的影響，如鹽濃度、pH值和溫度[19]。高壓微射流對米谷蛋白ζ電位的影響見表1。在酸性pH值下，NRG的ζ電位在36.73 mV附近，而酸法熱處理后HRG的ζ電位發生了顯著的變化，從36.73 mV顯著上升到52.63 mV（P＜0.05）。HRG具有較高的表面電荷，具有比NRG更高的正ζ電位，這與文獻報道的有關乳清蛋白的研究結果[20]相一致，表明HRG加強了靜電排斥，以抵抗進一步的聚集。同時HRG體系很穩定，通常膠體體系ζ電位絕對值超過20 mV（陰性或陽性），即為相對較穩定。在所施加壓力的范圍內，微射流處理對HRG的ζ電位均未產生顯著的影響（P＞0.05）。

2.4 高壓處理對米谷蛋白熱聚集體表面疏水性的影響

表面疏水性可以反映蛋白質表面疏水性基團的數量，它決定蛋白質分子間相互作用的能力，對蛋白質結構的穩定性、功能性質及構象具有重要的作用。如表1所示，NRG、HRG及HRG經高壓微射流處理后樣品的H0顯著增加（P＜0.05），表明熱處理和壓力處理改變了米谷蛋白的分子構象，這可能與谷蛋白分子的解折疊和原先嵌入在分子內部的疏水性氨基酸殘基的暴露有關。隨后，H0隨著微射流壓力的增加呈現先降低后增加的趨勢，但均不顯著（P＞0.05），即壓力超過35 MPa時H0逐漸減小，且達到140 MPa時又升高。這可能是由于經過酸法熱處理和隨著壓力的增加，谷蛋白的結構進一步展開，同時展開的眾多蛋白質分子又在疏水作用和二硫鍵的作用下重新聚集，谷蛋白聚集體疏水性基團減少使得H0降低；當壓力增大到140 MPa時H0增加到最大，表明更大的壓力使蛋白聚集體進一步去折疊，抑制了部分二硫鍵的生成，并且蛋白與重聚的結構發生重組，整體上促進了谷蛋白聚集體結構的展開，疏水性基團的暴露。

2.5 高壓處理對米谷蛋白熱聚集體暴露巰基含量的影響

圖3 高壓微射流處理對米谷蛋白聚集體暴露巰基、總巰基含量的影響Fig.3 Effect of HPM on total sulfhydryl and exposed sulphydryl contents of rice glutelin aggregates

巰基和二硫鍵是穩定蛋白質分子構象的重要化學鍵，對蛋白質的功能特性起著重要的決定作用。米谷蛋白經熱和高壓處理后的巰基含量變化見圖3。NRG暴露巰基和總巰基含量分別為12.47 mmol/g和24.18 mmol/g。熱處理對HRG暴露巰基含量幾乎無影響，總巰基含量稍有增加，表明蛋白結構發生輕微的解折疊；HRG再經不同壓力處理，暴露巰基含量仍無明顯變化，而樣品經35 MPa和70 MPa處理后總巰基含量顯著增加（P＜0.05），這可能是高壓處理使米谷蛋白中二硫鍵斷裂形成巰基的原因，通常熱加工或高壓處理會誘導發生二硫鍵/巰基的轉換[15,21]。進一步加壓處理，總巰基含量繼續減少，可能是由于壓力達105 MPa后米谷蛋白聚集體進一步解折疊，暴露了原先隱藏的巰基并被氧化重新形成二硫鍵的結果。

2.6 高壓處理對米谷蛋白熱聚集體熱特性的影響

表2 高壓處理對米谷蛋白熱聚集體熱力學參數的影響Table2 Thermodynamic parameters of rice glutelin aggregates

米谷蛋白樣品的差示掃描量熱分析結果見表2。差示掃描量熱分析圖上（圖略）顯示出不太明顯的吸熱峰，從焓變（ΔH）結果亦可知。當蛋白樣品置于鋁盤中從20 ℃升溫至100 ℃時，涉及變性（吸熱）和聚集（放熱）過程，這歸因于蛋白質分子內的解折疊和蛋白質分子間形成新的分子鍵[22]，同時，諸如蛋白質量濃度、溶液pH值、離子強度和加熱速度還會影響熱力學曲線。由表2可知，熱聚集后，HRG的Tp較NRG顯著增加，ΔH略有下降但不顯著，由此表明熱聚集的過程中，HRG分散體的熱穩定性明顯得到改善。高壓微射流處理熱聚集的米谷蛋白HRG，其Tp和ΔH的變化不是僅由熱聚集的變化引起的，表明高壓微射流處理對熱穩定性的改善有限；同時，隨著壓力的增大，Tp先增大后減小，ΔH的變化規律不明顯；而HRG-70的變性溫度最高，ΔH相對最小，表明該壓力下米谷蛋白在進一步聚集，HRG的熱穩定性可受高壓的影響，這與Yan Wei等[15]在高壓處理蛋黃方面的發現一致。

2.7 FTIR分析

采用FTIR計算每個組成的峰面積并對曲線進行擬合等[23]，大米谷蛋白聚集體的二級結構組成見表3。相比于NRG，加熱處理導致HRG中β-折疊結構含量減少，β-轉角、α-螺旋和無規卷曲結構含量增加；并且隨著處理壓力的增加，β-折疊結構進一步主要轉化為β-轉角和非天然α-螺旋結構，揭示了熱加工和高壓處理過程誘導蛋白質部分結構的展開，且高壓處理對結構改變起主導作用，這些與上述討論的蛋白質的表面疏水性結果保持一致。實際上，β-轉角結構被認為是維持蛋白質高度有序結構的產物，并且反向平行的折疊結構可以在聚集的蛋白質分子中形成，這也是蛋白質結構熱穩定性提高的原因[24]。綜上可知，大米谷蛋白經過加熱和高壓處理后導致的β-折疊構象通過展開轉變成高度有序的超分子結構，伴有更強的分子內部氫鍵，由此改善了蛋白的功能性質。

表3 FTIR估算分析大米谷蛋白聚集體的二級結構組成Table3 Secondary structure composition of rice glutelin aggregates estimated by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy

2.8 高壓處理對大米谷蛋白熱聚集體流變性能的影響

圖4 大米谷蛋白聚集體表觀黏度（a）和剪切應力與剪切速率（b）及剪切應力與剪切時間（c）的關系Fig.4 Relationships between shear rate and apparent viscosity (a)and shear force (b), and between shear stress and shear time (c) of rice glutelin aggregates

如圖4a所示，隨剪切速率的增加，所有樣品的表觀黏度下降，出現剪切變稀現象，表現出典型的假塑性流體特征。NRG和經高壓處理的HRG的表觀黏度相當，均較HRG的表觀黏度小，并且存在先下降后上升趨勢，與HRG存在明顯差異。表觀黏度差異性產生的原因可能是熱聚集導致HRG纖維化結構緊密度較高，其懸濁液表觀黏度較大，經高壓處理后分子結構展開，顆粒度增大，蛋白親水性增強，表觀黏度降低。隨剪切速率增大表觀黏度緩慢上升，可能主要是與大米谷蛋白溶液熱-高壓處理致凝膠結構的形成有關，且隨剪切速率增加結構愈致密，因而表觀黏度上升。圖4b中，剪切應力隨著剪切速率的增大而升高；在0.1～1 000 s－1的剪切速率范圍內，HRG顯著大于其他樣品的剪切應力；經高壓處理的HRG的剪切應力差別不大；在大于100 s－1的剪切范圍內，NRG大于經高壓處理HRG的剪切應力。一般來講，蛋白溶液的流變性質通過各種力的組合來確定，力主要取決于分散體的分子結構。此外，蛋白分散體的流動行為可以受顆粒尺寸和尺寸分布以及顆粒形狀和顆粒變形性的影響[25-27]。由此看來，熱處理的HRG的剪切應力特征的出現應該與其顆粒聚集形狀及顆粒的較難變形性有關。按照冪定律方程τ＝Kγn的計算，n值介于0.29～0.44之間，驗證此蛋白溶液為假塑性流體，同時HRG的K值顯著高于其他樣品，表明HRG溶液的稠度較大，符合實驗結果。在剪切速率為1 000 s－1的作用時間模式下的剪切應力變化如圖4c所示（樣品的表觀黏度變化趨勢及樣品間的差別與此一致，故不再贅述）。HRG的剪切應力顯著高于其他樣品，且數值逐漸變小，表明其蛋白結構在剪切作用下發生變化，分子間相對運動變得容易；其他樣品的變化趨勢不明顯，NRG的剪切應力顯著高于微射流處理的HRG樣品，同時隨著處理壓力的增大，剪切應力逐漸減小，表明微射流處理可引起大米谷蛋白熱聚集體結構的變化，從而使得其溶液剪切應力（同時表觀黏度）顯著變化。

2.9 高壓處理對米谷蛋白熱聚集體乳化性的影響

圖5 高壓微處理對米谷蛋白聚集體乳化性和乳化穩定性的影響Fig.5 Effect of emulsifying activity index on emulsifying stability index and emulsifying stability index of rice glutelin aggregates

EAI表示稀釋乳液中穩定界面處每單位質量蛋白質的覆蓋面積，ESI表示單位時間內相同稀釋倍數乳液的穩定性[28]。由圖5可知，HRG與NRG相比，EAI和ESI在熱聚集后顯著增加（P＜0.05），此結果類似于熱處理后乳清蛋白EAI的變化趨勢，隨著熱處理程度的增加乳清蛋白ESI也有所增加[23]。HRG-35的EAI和ESI與HRG相比沒有顯著差異（P＞0.05），HRG-70的EAI和ESI較HRG顯著增加（P＜0.05）。高壓處理的米谷蛋白熱聚集體表面疏水性顯著增加，顆粒尺寸增大以及表觀黏度降低，有利于米谷蛋白溶液EAI和ESI的改善。油滴表面上吸附的蛋白質緊密排列，這相當于在油-水界面形成連續的蛋白質膜[29]。HRG經105 MPa處理后乳液的EAI和ESI又有所降低，可能由于更高的壓力使聚集體結構遭到破壞，破碎成更小的粒子，吸附在油-水界面的蛋白總量較少，從而導致乳化活性下降[30]。

3 結 論

本實驗以自制秈米谷蛋白為原料，制備米谷蛋白纖維化熱聚集體并經過不同壓力處理，研究高壓微射流處理對米谷蛋白熱聚集體性質和結構的影響，主要研究發現如下：HRG有著致密網絡狀結構，較大的粒徑，熱穩定性和結構穩定性較高，其溶液體系穩定，表觀黏度高；隨著處理壓力的增大，HRG結構變得疏松，粒徑增大但分布范圍減小，總游離巰基含量先增加后減小，二級結構組成α-螺旋、β-轉角含量增加，β-折疊含量減少，乳化性及其穩定性呈現先上升后下降趨勢；ζ電位和表面疏水性的變化較小，高壓對熱穩定性有一定影響，表觀黏度變化明顯；微射流處理HRG時，低壓會使蛋白進一步聚集，較高的壓力則會使其解聚；70 MPa處理的HRG具有較好的乳化特性及熱穩定性。本研究為高壓微射流今后在食品工業中的應用提供數據支持。