蝦青素對肝脂代謝與晝夜節律的調節作用

左正宇，邵 洋，劉 楊，卜怡然，王華林，李 娜，劉志國*

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病，病程上可從單純性的脂肪性變性發展到非酒精性脂肪性肝炎，甚至肝硬化、肝癌[1]。NAFLD與肥胖、高脂血癥、II型糖尿病密切相關，被認為是代謝綜合征在肝臟中的表征[2-3]，已經成為一個嚴重的社會健康問題[4]。目前普遍被接受的NAFLD的發病機制是“二次打擊”學說[5]，其中細胞內以氧化應激為主的各種應激被認為是導致疾病發展的重要因素[6]。

蝦青素（astaxanthin，AX）是存在于微藻、真菌和甲殼類動物體內的一種脂溶性類胡蘿卜素[7-8]，它是一種天然的抗氧化劑，能夠猝滅活性氧并清除自由基[9]，具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病及心血管和神經保護等多種有益作用[10-11]。近年來，研究發現蝦青素可以改善高脂飲食誘導的肝功能障礙以及血脂升高，并能抑制炎癥因子的釋放，有效防止肝臟內質網應激、炎癥和脂肪沉積[7,12]，從而對改善NAFLD有積極作用。但蝦青素改善肝脂代謝的具體機制尚不十分清楚。特別是近年的研究發現高脂負荷可導致脂質吸收與代謝異常，同時也伴隨晝夜節律的紊亂，兩者的關系廣受關注[13]。

生物節律也稱生物鐘，是生物（尤其是哺乳動物）體內影響動物行為及各種生理生化活動，隨日落日出而呈現晝夜變化的自主性分子機制，它會隨外界環境（如光/暗、溫度等）變化而對節律作相應調整和修正[14]。對哺乳動物來說，生物鐘包括中樞時鐘系統與外周時鐘系統。中樞節律位于下丘腦的視交叉神經核，受外界環境改變和內源性物質的影響。外周節律存在于外周組織的肝、腸、心臟等器官中，調控外周組織的代謝活動，它一方面受中樞節律的控制，另一方面又受進食及營養因素的影響[15-16]。尤其對于肝臟來說，其既是全身營養代謝的中心，又是外周時鐘系統中的核心器官，通過晝夜節律調控體內能量代謝限速酶的表達以調節代謝的方向和速度[17]。高脂所致的代謝異常同時伴隨晝夜節律的紊亂，蝦青素通過改善氧化應激，緩解NAFLD的進展，這一作用是否與改善節律調節相關，或是否對代謝基因表達存在節律性的調節作用目前尚屬未知。

本研究通過高脂/高膽固醇飼喂建立NAFLD小鼠模型及添加蝦青素的干預模型，研究蝦青素對NAFLD代謝異常的改善作用以及對高脂所致的生物節律絮亂的干預作用。對研究蝦青素干預對晝夜節律的影響以及針對性地開展蝦青素營養干預具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級C57BL/6雄性小鼠60 只（許可證號：SCXK（鄂）2015-0018） 湖北省疾病預防控制中心湖北省實驗動物研究中心；蝦青素（質量分數5%） 中國科學院水生生物研究所；動物飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司。

TRIzol（生化試劑）、逆轉錄酶、寡核苷酸（18 nt Oligo（dT）） 寶生生物工程有限公司；dNTPs、異丙醇（分析純）、SYBR Green熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）Mix 北京艾德萊生物科技有限公司；氯仿（分析純）天津市天力化學試劑有限公司；反轉錄試劑盒 寶日醫生物技術（北京）有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測定試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）測定試劑盒南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

專業型梯度PCR儀 德國Biometra公司；超微量紫外分光光計 美國Thermo Fisher Scientif i c公司；酶標儀瑞士TECAN公司；qPCR儀 美國ABI公司；高速冷凍離心機 德國Sigma公司；正置光學顯微鏡、凝膠成像系統 日本NIKON公司；可見分光光度計 上海尤尼柯儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物及飼料配方

參考前期實驗建立動物模型[18]，選用SPF級C57BL/6雄性小鼠60 只，7～8 周齡，體質量（20f1）g，飼料參照Hayek西方飲食模型飼料配比，分為對照組（CON組）、高脂模型組（HFD組）、高脂添加蝦青素組（AX組）。飼料配方見表1，能量構成見表2。

表1 實驗動物的飼料配方Table1 Nutrient composition of diets g

表2 實驗動物的飼料能量構成Table2 Feed energy constituents

1.3.2 動物分組及造模

60 只小鼠均飼養于清潔級環境中，實驗條件設置為：溫度（23f2）℃，相對濕度55%～65%，12 h光照/12 h黑暗環境，即7：00開燈、19：00關燈。光暗環境中的時間用授時時間表示，ZT0為光照開始時間，ZT12為光照結束時間。適應性喂養一周后，對實驗小鼠按體質量排序隨機分成3 組（每組20 只），分別為CON組、HFD組、AX組。自由飲食，喂養11 周后測其糖耐量，12 周后每組各10 只分別在ZT0、ZT12兩個時間點處死，小鼠處死前禁食12 h，自由飲水。以5 mg/mL戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，腹主動脈采血，將血液置于放有肝素鈉的EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液保存于－80 ℃冰箱中待用。分離肝臟，一部分保存于－80 ℃冰箱，一部分固定于體積分數10%甲醛溶液中待用。

1.3.3 小鼠體質量、肝臟指數及脂肪指數的測定

在小鼠處死前，稱量每只小鼠的體質量并記錄。處死小鼠后，取出小鼠肝臟、腎周脂肪及附睪脂肪墊，用生理鹽水去除表面血污，濾紙吸干，稱質量記錄。小鼠肝臟指數與肥胖指數分別按照式（1）、（2）計算。

1.3.4 血清生化指標測定

在飼喂12 周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，腹腔麻醉，腹主動脈采血，分離血清，按照各血液生化指標試劑盒說明書方法分別檢測血清TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度和ALT、AST活力。

1.3.5 病理學檢測

取相同位置肝臟，放入盛有體積分數10%多聚甲醛溶液的標本瓶中固定。24 h后將固定的肝組織脫水，石蠟包埋并切片。切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，先后用伊紅、蘇木精染色和復染，梯度脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片，用顯微鏡觀察肝臟組織病理學變化。

1.3.6 qPCR檢測肝組織基因表達

采用TRIzol法提取肝臟總RNA，并按反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄操作。20 μL體系如下：總RNA 1 μg，5hgDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，5hPrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，4hRT Primer Mix 1.0 μL，加RNase free dH2O至20 μL。反應程序為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA保存于－80 ℃待用。

采用SYBR Green qPCR方法定量檢測相關代謝基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）基因、脂肪酸轉位酶（fatty acid translocase cluster determinant 36，CD36）基因、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）基因、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxy-lase，CYP7A1）基因以及節律時鐘基因時鐘晝夜節律調節器（clock circadian regulator，CLOCK）基因、腦和肌肉芳香烴受體核轉運體樣蛋白1（brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1）基因引物序列如表3所示，內參基因為β-Actin。20 μL體系如下：SYBR Green Mix 10 μL，RT-Product 2 μL，正向引物（300 nmol/L）0.6 μL，反向引物（300 nmol/L）0.6 μL，ddH2O 6.8 μL。最后根據qPCR儀給出的Ct值采用相對定量法計算實驗中目的基因mRNA的相對表達量。

表3 qPCR引物Table3 qPCR primers

1.4 數據統計分析

實驗數據采用Graphpad Prism 6.0軟件進行分析，檢測結果以fs表示，統計學差異分析方法采用ANOVA的Tukey’s test方法，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 蝦青素干預對小鼠體質量、肝臟指數以及肥胖指數的影響

如圖1所示，與CON組相比，HFD組的體質量高度顯著增加（P＜0.001）。AX組小鼠體質量與HFD組相比無明顯差異。HFD組小鼠肝臟指數相較CON組高度顯著增加（P＜0.001），而AX組與HFD組相比高度顯著降低（P＜0.001）。HFD組肥胖指數比CON組高度顯著增加（P＜0.001），添加蝦青素干預后，肥胖指數極顯著降低（P＜0.01）。上述結果表明，高脂飼喂導致了小鼠肥胖及肝臟肥大，使其脂肪沉積增加，而蝦青素干預則可顯著改善肝臟指數與肥胖指數。

圖1 蝦青素對小鼠體質量（A）、肝臟指數（B）與肥胖指數（C）的影響Fig.1 Effect of astaxanthin on body mass (A), liver index (B) and obesity index (C) in mice

2.2 蝦青素干預對小鼠血脂水平及晝夜節律的影響

從圖2可以看出，高脂/高膽固醇飼喂12 周后，小鼠血清主要血脂水平呈現總體升高趨勢（HDL-C濃度下降），尤其以TC和LDL-C濃度升高顯著，而經過蝦青素干預后，高脂所致血脂異常得到顯著改善。進一步觀察血脂的晝夜節律變化情況，結果顯示不同血脂指標在ZT0（早）、ZT12（晚）間呈現不同的變化規律且差異明顯。

圖2 小鼠血脂水平及晝夜節律變化Fig.2 Changes in blood lipid levels and circadian rhythm in mice

小鼠是夜間活動的動物，與人的晝夜節律相反。本實驗中，ZT0是光照開始的時間，對應于小鼠夜間活動結束；ZT12是光照結束的時間，對應于小鼠休息結束的時間。圖2顯示，各組TG濃度在ZT0時均極顯著高于ZT12時（P＜0.01，P＜0.001），呈現顯著的早晚差異。ZT12時HFD組TG濃度高于CON組，但差異不顯著，而AX組TG濃度均顯著低于HFD組（P＜0.05）。TC濃度的晝夜節律變化與TG濃度有所不同，各組在ZT0時TC濃度均略低于ZT12時，但無顯著性差異。其中HFD組不管在ZT0時還是ZT12時均高度顯著高于CON組，而AX組經蝦青素干預后TC濃度明顯恢復，并在ZT12時顯著低于HFD組。LDL-C濃度的變化更為顯著，CON組在ZT12時LDL-C濃度顯著高于ZT0時（P＜0.05），表明正常飼養時小鼠LDL-C濃度呈現典型的晝夜節律變化；在高脂飼養條件下，LDL-C濃度大幅升高，早晚間的差異消失，蝦青素干預則顯著降低了LDL-C濃度，但尚未恢復到正常水平和晝夜節律。HDL-C濃度的變化與LDL-C濃度相反，CON組在ZT0時高于ZT12時，HFD組在ZT0時高度顯著降低，且晝夜節律消失，而蝦青素干預可大幅提高HDL-C濃度。

總地來說，高脂飼喂導致小鼠肝臟血脂水平升高（HDL-C濃度除外），尤其是TC濃度升高明顯，而蝦青素干預可以有效降低TC和LDL-C濃度，升高HDL-C濃度，改善脂質的代謝。血脂的晝夜節律波動是正常的生理現象，反映了機體晝夜代謝活動的差異，高脂飼養條件下，脂代謝的負荷增加，打破了正常的脂質波動規律，呈現異常的血脂晝夜節律變化。推測蝦青素干預能改善脂質代謝，部分恢復血脂水平和正常節律。

2.3 蝦青素干預對高脂誘導的肝損傷的緩解作用

當肝細胞受到實質性損傷時，胞漿中的ALT與AST會被釋放出來，導致其在血清中的活力上升。因此，血清中ALT、AST活力是衡量肝損傷的最佳特征標記。圖3結果顯示，與CON組相比，HFD組小鼠血清中ALT和AST活力均高度顯著升高。AX組ALT、AST活力較HFD組極顯著降低，但沒有回落到CON組水平。表明HFD組小鼠存在顯著的肝受損情況，添加蝦青素干預則可顯著緩解肝臟的損傷。

圖3 小鼠血清AST（A）、ALT（B）活力Fig.3 Serum AST (A) and ALT (B) activity in mice

2.4 肝臟組織病理學變化分析

圖4 小鼠肝臟組織HE染色結果Fig.4 HE staining of liver tissue in mice

如圖4所示，HFD組小鼠肝葉細胞腫脹，大小不一的脂滴散布于胞質中，細胞核居邊，細胞與細胞之間的界限模糊不清，肝竇狹窄，肝小葉內及匯管區有炎性細胞浸潤。AX組脂肪變性與炎性浸潤程度較HFD組都有相應減輕。

2.5 蝦青素對肝臟脂代謝相關基因mRNA表達情況的影響

圖5 肝臟脂代謝相關基因mRNA表達情況Fig.5 mRNA expression of hepatic lipid metabolism-related genes

如圖5所示，FASN是內源性脂肪酸合成的限速酶，在控制脂肪酸合成中具有重要作用。CON組中FASN mRNA的表達存在顯著的晝夜節律變化，即ZT0時（反映動物的活動狀態）的mRNA表達量高度顯著高于ZT12時（反映動物的休息狀態）（P＜0.001）；而在高脂飼養條件下，FASN mRNA表達的節律變化發生顯著改變，在ZT0時mRNA表達量極顯著低于CON組（P＜0.01），而在ZT12時反而高度顯著高于CON組，反映了高脂飼養導致FASN mRNA表達及內源性脂肪酸合成節律的絮亂。經蝦青素干預后，FASN mRNA的表達量恢復到正常節律特征（ZT0時高、ZT12時低），并均低于CON組的表達水平，表明添加蝦青素干預后，FASN mRNA表達及其代表的內源性脂肪酸合成在ZT0和ZT12時同步受到抑制。

CD36是肝細胞上攝取脂肪酸的受體，其mRNA表達也呈現晝夜節律變化，其在ZT0時的表達量高于ZT12時。而HDF組CD36 mRNA的表達顯著上調，早晚間的表達量差異縮小。蝦青素干預則可同步增加CD36 mRNA在早晚的表達量。

上述結果表明，蝦青素對改善高脂條件下內源性脂肪酸的合成和血液中脂肪酸的攝取有顯著作用，同時其對高脂所致相關基因表達的節律紊亂有較好的保護作用。

2.6 蝦青素干預對肝臟膽固醇代謝相關基因mRNA表達與節律變化的影響

如圖6所示，HMGCR是膽固醇合成的關鍵酶，HMGCR節律表達特征與FASN和CD36完全不同，它主要以ZT12時（小鼠的休息時間）的表達為主。正常小鼠HMGCR mRNA水平在ZT12時高度顯著高于ZT0時。HFD組HMGCR mRNA早晚的表達都高度顯著降低，但以ZT12時為主，此時，膽固醇的合成受到顯著抑制，早晚間的波動差距（幅度）減小。AX組有所恢復，但作用并不明顯。

圖6 肝臟膽固醇代謝相關基因mRNA表達與節律變化Fig.6 mRNA expression and circadian rhythm of hepatic cholesterol metabolism-related genes

CYP7A1是膽固醇氧化合成膽汁酸的關鍵酶，其表達的上調可促進肝臟膽固醇從膽汁中排出。CON組在ZT12時的CYP7A1 mRNA表達量極顯著低于光照開始（ZT0）時，而HFD組則主要在ZT12時表達量升高，從而表現出與CON組相反的晝夜節律波動，AX組可以糾正這種波動異常，主要上調ZT0時的表達，與CON組相似。

2.7 蝦青素對肝臟時鐘基因mRNA表達量及晝夜節律的影響

生物鐘核心轉錄因子CLOCK/BMAL1通過結合轉錄調控元件增強盒（enhancer-box，E-box）調控時鐘基因的表達及晝夜節律變化。核心回路中，BMAL1和CLOCK在細胞核內形成異二聚體與PER和CRY基因啟動子區的E-box結合，從而激活PER與CRY基因的轉錄。當PER與CRY在細胞質中的積累達到閾值，PER和CRY蛋白形成二聚體PER/CRY，進入細胞核競爭性抑制CLOCK/BMAL1二聚體與E-box結合從而抑制其轉錄，通過這種負反饋調節參與生理過程與生物鐘的調控。

如圖7所示，CON組CLOCK mRNA的表達存在顯著的晝夜節律變化，ZT0時高度顯著高于ZT12時（P＜0.001）。高脂飼養條件下晝夜節律消失，在ZT0時HDF組高度顯著低于CON組（P＜0.001）；而在ZT12時HFD組略低于CON組，但無顯著性差異。CLOCK/BMAL1是生物體內相對保守的、以轉錄-翻譯為基礎的自身轉錄調節回路。有研究表明，BMAL1基因的絕對表達量低于CLOCK基因，所以BMAL1基因的mRNA表達調控著CLOCK/BMAL1異二聚體含量[19]。BMAL1基因的表達存在著顯著的晝夜節律，光照開始時（ZT0），HFD組極顯著低于CON組，經蝦青素干預后BMAL1 mRNA表達量得到高度顯著恢復（P＜0.001）；在光照結束時（ZT12）BMAL1 mRNA表達量高度顯著低于光照開始（ZT0），且各組間mRNA表達量趨于一致，且無顯著差異。高脂飼養條件下，BMAL1 mRNA表達量晝夜節律振幅降低，蝦青素干預能改善高脂所致的節律異常。

圖7 生物鐘核心轉錄因子CLOCK（A）、BMAL1（B）mRNA表達與節律變化Fig.7 mRNA expression and rhythmic changes of biological clock core transcription factor CLOCK (A) and BMAL1 (B)

3 討 論

目前關于NAFLD發病機制的研究已取得非常大的進展，“二次打擊”（肝脂肪變性所形成的“初次打擊”及細胞內氧化應激等導致的“二次打擊”）學說已被普遍認同[5]。高脂/高膽固醇飲食會引起顯著的脂質積累和氧化應激，并可能誘發NAFLD等多種慢性代謝疾病[20-21]。蝦青素是天然的抗氧化劑[22]，能改善高脂飲食所致的肝臟氧化應激狀態和脂質過氧化[23-24]，從而打破高脂小鼠的肝臟氧化應激和末端激酶激活的惡性循環[25]。本研究結果顯示，飼喂12 周后HFD組小鼠體質量、肝臟指數和肥胖指數均顯著增加，蝦青素干預能顯著抑制高脂/高膽固醇飲食誘導的肝臟指數、肥胖指數的增加。蝦青素還能降低小鼠肝臟TC和LDL-C濃度，提高HDL-C濃度，降低ALT、AST活力，從而降低血脂水平，緩解肝臟的損傷。在代謝途徑上，檢測結果顯示蝦青素能降低脂肪酸合成限速酶FASN的表達，抑制脂肪酸的合成，此外，蝦青素也能降低膽固醇合成關鍵酶HMGCR在肝臟中的表達，減少內源性膽固醇的合成，同時提高CYP7A1的表達，促進膽固醇氧化生成膽酸，促進膽固醇的分泌與排出[26]。有研究顯示，蝦青素可誘導肝組織ATP結合盒轉運蛋白A1/G1的表達，從而增強了載脂蛋白A-1/HDL介導的肝X受體（liver X receptor，LXR）非依賴性巨噬細胞膽固醇流出[27]。這與本實驗觀察到AX組小鼠HDL-C濃度顯著高于CON組與HFD組相印證。

哺乳動物的代謝活動具有明顯的節律特點，肝臟作為外周時鐘系統的主要器官控制組織的代謝節律[25,28]。核心節律轉錄因子CLOCK和BMAL1及其靶基因PER和CRY構成自反饋調節機制，PER和CRY基因表達產物又反饋抑制CLOCK-BMAL1復合物，抑制其自身的表達[29]。核心回路與代謝相關核受體相連接，通過核受體亞家族1 D組成員1（nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，REV-ERBα）[19]、維甲酸相關孤核受體α（retinoid-related orphan receptor α，RORα）[30]及過氧化物酶增殖體激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα）[31-32]調節代謝。REV-ERBα和RORα既可以反饋調節核心節律分子的表達，也可以影響胰島素誘導因子2（insulin-induced gene 2，INSIG2）的表達，促進了固醇調節元件結合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBPs）的激活[30,33]。SREBPs決定著膽固醇和脂肪酸合成中具有關鍵功能的酶的節奏表達[34]。有研究顯示，SREBP2調控HMGCR的循環轉錄，膽固醇節奏性的產生可以引起LXR核受體的循環激活，其作為CYP7A1轉錄的關鍵激活劑催化膽汁酸合成中的限速步驟，受核因子法尼酯X激活受體/小異二聚體伴侶途徑的調控，后者也同時受REV-ERBα的調節[35]。因此，節律循環通過核受體介導調節脂肪酸與膽固醇的合成與代謝，從而改善脂質代謝。本研究中，高脂/高膽固醇飼喂導致小鼠脂代謝負荷增加的同時，也破壞了正常的脂質波動規律，蝦青素干預能夠緩解或修正由高脂導致的生物鐘節律相關基因CLOCK和BMAL1以及肝臟早晚脂質和膽固醇代謝相關基因晝夜節律表達的紊亂。文獻[36]報道，蝦青素是PPARα的激動劑，PPARα可以通過與BMAL1和REV-ERBα的啟動子區域PPAR反應元件結合，調節BMAL1與REV-ERBα的轉錄[37]，此外，PPARα通過促進INSIG2的表達抑制SREBPs的活化[38]。這與本實驗中觀察到的HFD組BMAL1 mRNA表達量顯著低于CON組，蝦青素干預后極顯著恢復相似。通過這一證據可以推測，蝦青素對生物鐘的調節作用也許與蝦青素能增強PPARα的活力有關。

本實驗研究了蝦青素對NAFLD的干預作用，并觀察了蝦青素對高脂所致節律紊亂的改善作用。為進一步研究蝦青素的營養干預及其節律調節作用提供了依據。