羧甲基纖維素強化膠原纖維膜的制備及其性能分析

程 珊，王穩航*，滕安國，張 凱，周敬陽，吳子男

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

膠原蛋白又稱膠原，是在結構上既有共性又各有差異的一類成員高達28 種的蛋白質家族，也是細胞外基質的一種結構蛋白，廣泛存在于動物體內結締組織中，起到支撐器官和保護機體功能的作用[1]。在顯微鏡下觀察膠原分子為細棒狀，由原膠原按照規則平行排列成束，形成膠原微纖維，并進一步聚集成束組成粗細不等的膠原纖維[2]。天然緊密的分子排列以及高的長徑比（約200）賦予膠原蛋白分子高彈性模量和強柔韌度，使膠原蛋白成為能制備既有優良機械強度又有足夠延展性生物材料的重要原料[3]。

近年來，除了生物領域，食品領域也開始增加了對膠原蛋白及其材料（膜和腸衣）的研究。其中，Harper[4]、Barbut[5-6]等對膠原蛋白腸衣的性能進行了全面評價；Wolf等[7]以膠原纖維和膠原粉為原料成功制備了膠原蛋白膜，并評價了其性能；Oechsle等[8-10]率先研究了膠原纖維的酸溶脹機制，以及膠原與其他蛋白的相互作用。實際上，膠原纖維被廣泛應用到人造腸衣中，并且在19世紀五、六十年代開始商業化[3]。目前，膠原蛋白腸衣據估計已占可食腸衣的80%以上[11-12]。盡管膠原蛋白腸衣是一種成功商業化的可食蛋白膜，但是高親水性和低熱穩定性使其與石油基材料相比，機械性能和阻隔性能還有待提升[13]。除了可利用化學、物理、酶法等方法促進膠原分子間交聯的手段提高膠原材料性能外[14-15]，還可以通過與其他高分子聚合物（如蛋白質、多糖、淀粉、纖維素等）相互作用提高其復合材料性能；其中基于靜電相互作用的蛋白-多糖交聯已成為研究熱點[16]。比如膠原蛋白在生物體內能夠與陰離子多糖硫酸軟骨素類等緊密結合，從而增加了其生物穩定性。而在實際生產中，如在膠原蛋白腸衣的制備過程中，加入黏合劑羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）可以增強膠原纖維之間相互作用，以提高腸衣的機械強度，這種具有交聯網狀結構的復合膜明顯比單一組分膜的機械性能和阻隔性能更優；因此在食品行業具有廣闊的應用前景，但是其具體添加行為以及對成膜液和膜性能的確切影響及機制鮮見報道。

本實驗以膠原纖維為成膜基質，基于帶正電荷的膠原蛋白與帶負電荷的CMC靜電相互作用的原理，將不同比例的CMC溶液添加到膠原纖維懸浮液中制備成復合膜，通過研究復合膜的特性得到較佳的成膜材料配比，并對其機制進行探討。實驗一方面可為基于靜電相互作用的蛋白-多糖聚合對其成膜性能的影響機制進行闡明；另一方面可為膠原蛋白膜性能的提高以及具體的實際應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛皮 山東省淄博龍寶生物有限公司；CMC（黏度400～800 cP，溶解度20 mg/mL） 天津西瑪科技有限公司；冰醋酸、硫代硫酸鈉、碘化鉀等（均為分析純）天津市北方天醫化學試劑廠；三氯甲烷、氯化鈣、鹽酸、甘油等（均為分析純） 天津市江天化工技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CH-1-ST型測厚儀（靈敏度0.003 mm） 上海六菱儀器廠；SP-2102型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TA.XT. Plus型質構儀 英國Stable Micro Systems公司；SU 1510型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；pH-3CW型酸度計 上海理達儀器廠；EMS-18型磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；TS-37型Zeta-電位分析儀 英國馬爾文公司；DSC60型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）日本Shimadzu公司；VECTOR 22傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀德國布魯克儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 牛皮膠原纖維的提取及其懸浮液的制備

牛皮為經100 g/L堿石灰室溫下浸泡30 d處理后的pH 12的二層皮。將其剪成10 cmh10 cm小塊，在蒸餾水中浸泡至中性（每2 h換一次水），取出瀝干，按1∶3（m/V）浸沒在0.01 mol/L的鹽酸中，20 ℃下進行充分酸溶脹24 h后，用鑷子輕輕刮取其膠原纖維，用蒸餾水配制成質量分數1.0%的膠原纖維懸浮液，調節其懸浮液的pH值至2，并于4 ℃冰箱中儲存，以備后期使用。

1.3.2 復合成膜液配制與CMC添加量的選擇

實驗首先選取質量分數1.0%的CMC懸浮液0、2.50 g和5.0 g緩慢加入到50 g、質量分數1.0%的膠原纖維懸浮液中，制備成CMC添加量為0、5%、10%（以膠原纖維質量計）的膠原纖維-CMC混合液，并置于磁力攪拌器中攪拌20 min，室溫下放置8 h充分反應。觀察復合成膜液的表觀現象。實驗結果表明CMC的添加量超過5.0%后會發生團聚甚至分層的現象（圖1c），不能形成成膜液。隨后按照上述相同的配制方法分別取質量分數1.0%的CMC懸浮液0、0.25、0.50、1.25 g和2.50 g緩慢加入到50 g、質量分數1.0%的膠原纖維懸浮液中，制備成CMC添加量為0、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%（以膠原纖維質量計）的膠原纖維-CMC混合液，并置于磁力攪拌器中攪拌20 min，室溫下放置8 h充分反應。

1.3.3 CMC添加量對復合成膜液ζ-電勢和pH值的影響

參照Pan Kang等[17]的方法，分別利用Zeta-電位分析儀、酸度計檢測膠原纖維-CMC復合成膜液的ζ-電勢和pH值。

1.3.4 膠原纖維-CMC復合膜的制備

按膠原纖維-C M C復合液干物質質量的1 0%添加甘油，攪拌5 m i n后倒入聚四氯乙烯（poly(tetrafluoroethylene)，PTFE）平板（15 cmh15 cm）鋪膜，置于35 ℃鼓風干燥箱中干燥8 h，將復合膜從PTFE板中慢慢揭下。所有膜在分析前要置于（23f2）℃、相對濕度（50f1）%的干燥器中儲存7 d。

1.3.5 SEM觀察

利用SEM觀察復合膜的表面和斷面結構。觀察膜的橫截面時，樣品膜置于液氮中進行脆斷，裁剪成0.5 cmh0.5 cm小塊，粘貼在導電膠帶上，樣品噴金后在SEM下觀察。

1.3.6 厚度與透光率的測定

選取膜上的4 個邊緣處和中心點處，利用測厚儀（靈敏度為0.003 mm）測量，測量3 次取平均值；參照王碧等[18]的方法，利用紫外-可見分光光度計測量膜在600 nm波長處的吸光度并按照式（1）計算透光率。

式中：A為吸光度；T為透光率/%。

1.3.7 機械性能的測定

使用質構儀檢測復合膜的拉伸強度、斷裂延伸率和楊氏模量，具體計算參考文獻[19]。

1.3.8 水蒸氣透過率、氧氣透過性的測定

水蒸氣透過率參考王亞斌等[20]的方法進行測定；采用油脂的過氧化值（peroxide value，POV）來表示氧氣透過性，具體方法參照張祿生等[21]的方法并稍作修改，為避免加入指示劑過量使結果偏大，將文獻中加入的飽和碘化鉀溶液與淀粉溶液量均修改為0.5 mL，反應時間延長至1 min。實驗結果具體數值以每千克樣品中活性氧的當量（mg/kg）表示。

1.3.9 復合膜溶脹速率曲線及溶脹動力學分析

樣品膜在室溫下于蒸餾水中孵化5、30、60、120、180、360 min，用濾紙將膜表面擦干，立即稱其質量。溶脹率按式（2）進行計算[22]。

式中：mt為樣品在蒸餾水中溶脹后的質量/g；m0為膨脹前干物質的質量/g。

本實驗利用Jindal[22]、Zakir Hossain[23]等的Schott二階動力學模型（式（3）），進一步研究復合膜的溶脹動力學。

式中：t為溶脹時間/s；St為復合膜在時間t時的溶脹度/（g/g）；S∞為理論平衡溶脹度/（g/g）；Kis為起始溶脹速率常數。

利用Schott二階動力學模型計算復合膜室溫下在蒸餾水中孵化后的溶脹性能，通過線性回歸方程來進行線性擬合。

1.3.10 熱穩定性的測定

稱取3～5 mg復合膜樣品，置于鋁盒中，壓緊后以氣流量50 mL/min的氮氣保護。以空鋁盒為參比，控制升溫速率為10 ℃/min，溫度從25 ℃升高至250 ℃，進行DSC分析。

1.3.11 FTIR的測定

利用FTIR儀測定復合膜的紅外光譜。掃描波數為500～4 000 cm－1，分辨率為4 cm－1，掃描次數為30。

1.4 數據統計分析

所有實驗數據表示為平均值±標準差。利用SPSS 17軟件的Duncan法分析檢驗顯著性差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CMC添加量對復合成膜液絮凝行為的影響

本實驗室CMC的添加量設定為0%～5.0%，因為超過5.0%后會發生團聚甚至分層現象（圖1c），不能形成成膜液。這種現象可解釋為：1）CMC溶于水，基于－OH形成分子間和分子內的氫鍵作用，在水溶液中膨脹形成膠狀液，當CMC的添加量不超過5.0%時，CMC能完全分散到膠原纖維懸浮中，并未出現團聚或分層現象，過量的CMC擾亂了分子結構的有序性，使混合液展現出較差的生物相容性[24]；2）膠原纖維懸浮液的穩定性也依賴于其在酸性溶液中正電荷的靜電排斥作用[25]，CMC與膠原纖維結合后表面電荷趨近于等電點，混合成膜液展現出相對不穩定現象。當CMC的添加量不超過5.0%時，混合成膜液中二者之間兼容性較好，CMC能完全分散到膠原纖維懸浮中，不出現團聚或分層現象。因此，考慮到CMC添加量不斷增大可能會引起更大程度的聚集，以及產生明顯的相分離行為，而不能保持成膜的穩定性，故選用5.0%及以下添加量的CMC用于成膜液及膜的性質研究。

圖1 CMC的添加量對成膜液絮凝行為的影響Fig.1 Effect of CMC addition on fl occulation behavior of fi lm-forming suspension

綜上所述，添加的一定量CMC（不超過5.0%）可通過靜電相互作用增加與膠原蛋白的相互作用和結合強度，在后續的成膜過程，氫鍵作用繼續增加了這兩種物質自身以及兩者之間的聚合，從而達到對膜的微觀結構、機械強度以及阻隔性能提升的作用?？偨YCMC與膠原纖維相互作用的機理圖如圖2所示。

圖2 膠原纖維和CMC相互作用機理圖Fig.2 Schematic of interaction between collagen fi ber and CMC

2.2 CMC添加量對復合成膜液的ζ-電勢和pH值的影響

從表1可以看出，當CMC的添加量在1.0%～5.0%范圍內增加時，ζ-電勢迅速降低，最終達到（17.50f0.26）mV，這可能是由于CMC為聚陰離子物質，表面帶負電荷，聚合物的表面電荷會影響膠體的穩定性，當兩種聚合物結合后表面電荷趨近于等電點時，ζ-電勢越小，分子間斥力越小，生物聚合物之間越不穩定，甚至發生團聚現象[26]。另外，隨著CMC添加量的增加，混合成膜液的pH值沒有顯著變化（P＞0.05），這說明向膠原纖維懸浮液中添加CMC對成膜液的pH值影響很小。

表1 CMC添加量對復合成膜液的ζ-電勢和pH值的影響Table1 Effect of CMC addition on ζ-potential and pH of composite fi lm-forming suspension

2.3 CMC添加量對復合膜微觀結構的影響

圖3 CMC添加量對復合膜微觀結構的影響Fig.3 Effect of CMC addition on microstructure of composite fi lm

從復合膜表面SEM圖（圖3A1～E1）可以看出，純膠原蛋白膜的表面比較光滑（圖3A1），隨著CMC添加量的增加，復合膜的表面越來越粗糙，當CMC添加量增加到5.0%時，粗糙度最大，說明膠原纖維-CMC聚合程度隨CMC添加量增多越來越大；從復合膜的橫斷面SEM圖（圖3A2～E2）可以看出，CMC添加量也影響膜內部的微觀結構，隨著CMC添加量的增加，復合膜的微觀結構越來越緊實，CMC鑲嵌到膠原纖維有序的纖維列隊中，表面形態會影響膜的表面粗糙度和透光性，這也與透光率的測定結果一致。圖1也表明，CMC的添加量不超過5.0%時，CMC能均勻分散至膠原纖維懸浮液中，充分展示了良好的生物兼容性，同時保持了二者之間結合的穩定性，這與復合成膜液的ζ-電勢結果相統一。這可解釋為帶正電荷的膠原纖維與帶負電荷的CMC之間聚集作用增強，靜電相互作用加強，氫鍵作用進一步增加，從而構成二者之間相互交聯的三維網絡狀結構。

2.4 CMC添加量對復合膜厚度和透光率的影響

表2 CMC的添加量對復合膜厚度和透光率的影響Table2 Effect of CMC addition on thickness and light transmittance of composite fi lm

由表2可以看出，隨著CMC添加量的增加，復合膜的厚度顯著增加（P＜0.05），這主要是由于CMC具有較強的分子柔性，能夠分布于膠原纖維間達到孔隙填充的目的，CMC的添加量增加導致膜物質總量增加；另外靜電相互作用的膠原纖維與CMC聚合度增加而使膜表面的粗糙度增加也是原因之一[27]，這也與SEM圖的結果相一致。

純膠原蛋白膜的透光率為85.16%，隨著CMC添加量的增加，復合膜的透光率降低，添加量為5.0%時透光率降低至74.4%。這種現象可解釋為：CMC填充在膠原纖維之間，使可食膜的網絡結構變得致密，影響光路通過[28]，導致膜透光率下降。這也與相關研究的結果一致[29]：CMC的COO－與膠原蛋白NH4＋靜電相互作用、H2O與膠原蛋白之間的氫鍵作用都可促進聚集，導致透光率下降。

2.5 CMC添加量對復合膜機械性能的影響

圖4 CMC的添加量對復合膜機械性能的影響Fig.4 Effect of CMC addition on mechanical properties of composite fi lm

從圖4A中可以看出，純膠原蛋白膜的拉伸強度為（48.80f1.44）MPa，隨著CMC添加量的增加，復合膜的拉伸強度顯著增加（P＜0.05）；當CMC添加量為5.0%時，此時的拉伸強度達到最大值（（79.18f1.71）MPa）。通常，膜的拉伸強度主要依賴于分子間以及分子內的強烈相互作用，帶相反電荷的膠原纖維和CMC因靜電作用而相互吸引，膠原纖維肽鏈中的—COOH、—NH2與CMC的—OH形成交聯而提高膜的拉伸強度；與之相反，膜的斷裂延伸率隨著CMC添加量的增加顯著性降低（P＜0.05）（圖4B），這與加入CMC后膜基質的流動性降低導致斷裂延伸率下降[30]有關。從圖4C可看出，隨著CMC的添加量增加，膜的楊氏模量顯著增加（P＜0.05）；當CMC添加量為5.0%時，此時復合膜的楊氏模量是純膠原蛋白膜的近2 倍。由此可知，CMC不僅能和膠原纖維形成交聯結構，二者之間也會形成分子間的相互作用，如氫鍵、靜電引力，從而形成致密的網絡結構，致使膜具有較高強度。因此添加5.0%的CMC可使膜的機械性得到有效強化。

2.6 CMC添加量對復合膜水蒸氣透過率與氧氣透過性的影響

圖5 CMC添加量對復合膜水蒸氣透過率（A）和氧氣透過性（B）的影響Fig.5 Water vapor permeability (A) and oxygen barrier property (B) of composite fi lms added with different concentrations of CMC

從圖5 A可以看出，純膠原纖維膜的水蒸氣透過率為（36.65f0.48）g/（mgsgPa），當添加5.0% CMC時，復合膜的水蒸氣透過率降低至（32.41f0.86）g/（mgsgPa）。如圖5B所示，CMC添加量從0%增加至5.0%時，POV顯著降低（P＜0.05），這主要是因為CMC為結晶度較高的纖維素衍生物，在結構上阻擋了外來小分子的進入，且CMC鏈中含有的大量親水性基團（如—COONa、—COOH和—OH）與膠原纖維形成致密的網絡交聯結構，并與小部分水分子形成水化膜，使水分子在膜中擴散速率減慢，阻礙水蒸氣通過[31]。同時，CMC與膠原纖維交聯形成密集的網絡結構，形成較長的曲折路徑，小分子（如O2）很難穿過可食膜基質，導致透氧性降低[32]。由此可知，向膠原蛋白中添加0%～5.0% CMC可以有效提高膜的阻隔性能。

2.7 CMC添加量對復合膜膨脹動力學性能的影響

圖6 CMC的添加量對復合膜溶脹率（A）和溶脹動力學性能（B）的影響Fig.6 Effect of CMC addition on swelling ratios (A) and kinetics (B) of composite fi lm

從圖6A中可以看出：在0～60 min內，所有膜快速吸收水分，溶脹率先急速增加；在60～180 min內，溶脹率增長速率降低，180 min后趨于緩慢。圖6B實驗值的趨勢線展現出良好的線性相關性（R2≥0.998），表明復合膜在溶脹過程中較好地符合Schott的溶脹擬二階動力學模型。

可食膜的溶脹性能取決于含有親水性官能團基質以及膜的有效交聯密度[3]。膠原纖維分子鏈及側鏈中含有大量的親水基團使其具有很強的水吸收能力，因而具有較高的初始溶脹率。添加CMC后，膜快速吸收水分導致分子間隙增大，膠原纖維緊密的結構被打破，并與水分子的作用力增大，從而吸水溶脹，這與Adzaly等[30]的實驗結果類似。實驗結果表明，CMC添加量對復合膜的溶脹性能具有顯著性影響。

2.8 CMC添加量對復合膜熱穩定性的影響

圖7 添加不同含量CMC復合膜的DSC曲線Fig.7 DSC curves of composite fi lms added with various concentrations of CMC

從圖7可以看出，所有的樣品膜有兩個吸收峰，分別為膠原蛋白的三股螺旋結構轉化為雜亂無序的單鏈結構的玻璃化轉化峰（峰值溫度用Tg表示）和水分子間的熔融轉變峰（峰值溫度用Tm表示）[33]。在第二個吸收峰中，峰值溫度的變化與膠原纖維分子的降解密切相關[32]。從圖7可以看出，純膠原蛋白膜Tm值為158.92 ℃，Tg值為96.84 ℃，添加CMC后復合膜的Tm值提高而Tg值減小。這種現象歸因于CMC的添加破壞了膠原纖維的三螺旋結構，從而使螺旋結構轉變為雜亂無序的單鏈結構更容易，因此Tg值減小。同時膠原纖維和CMC結合后形成有效的交聯網絡，膠原纖維和CMC之間的靜電引力和氫鍵的作用提高了復合膜的熱穩定性，破壞膠原蛋白結構需要更高的溫度，從而使Tm值增大。

2.9 CMC添加量對復合膜FTIR光譜的影響

從圖8中可以看出，純膠原纖維膜的FTIR光譜圖有4 個峰，分別在3 316.51、1 652.45、1 552.22、1 239.35 cm－1波數處，這些峰分別代表酰胺A的NüH和OüH伸縮振動、酰胺I的C＝O伸縮振動、酰胺II的NüH彎曲振動、CüH伸縮振動、酰胺III的CüN伸縮振動[33]。CMC在3 431.96 cm－1和1 054.15 cm－1處有由OüH和CüO伸縮振動引起的特征吸收峰[32]。添加CMC后，膠原纖維對應的吸收峰波數轉移到3 308.20、1 632.35、1 546.15、1 235.88 cm－1處。這些峰發生位移可歸因于CMC的羥基和膠原纖維的羧基發生強烈的反應，生成氫鍵使伸縮振動譜帶強度加強，—OH吸收峰向低頻移動。

圖8 膠原纖維膜、CMC膜以及含5% CMC復合膜的FTIR光譜Fig.8 FTIR spectra of CMC, pure collagen fi lm and composite fi lm added with 5% CMC

3 結 論

本實驗基于靜電相互作用的原理，通過測定CMC添加量對膠原纖維復合膜各項性能指標的影響，確定了CMC能夠與膠原纖維有效結合并有效改善膜的機械強度和阻隔性能。當CMC的添加量不超過5.0%時，成膜液中膠原纖維與CMC能夠穩定存在，相容性好，而過多的CMC添加量則使兩者易于發生聚合，成膜性差甚至不能成膜。在CMC添加范圍內（0%～5.0%），隨著CMC添加量的增加，復合成膜液的ζ-電勢顯著降低，而pH值無明顯變化，膜的厚度逐漸增加，而透光率顯著降低，復合膜的拉伸強度和楊氏模量顯著性增加，而斷裂延伸率顯著下降；此外，CMC的加入提高了膜的阻隔性能和熱穩定性，也導致膜溶脹動力學發生了改變。綜上，CMC能夠與呈正電性的酸溶脹膠原纖維發生靜電相互作用，在一定添加范圍內（添加量不超過5.0%）能夠有效提高膠原纖維膜的機械強度和阻隔性能，因此在膠原蛋白基可食膜如膠原蛋白腸衣的性能提升與改良中具有潛在應用價值。

但由于本實驗中CMC添加量選擇范圍較窄，對于膠原蛋白-CMC相互作用（包括相容性、溶液穩定性等）的具體理論機制需要進一步研究。此外，以CMC作為強化劑添加到膠原蛋白可食膜中，膜的可食性、生物相容性以及生物降解性有待研究。