高氧氣調包裝貯藏牛排肉色穩定性的蛋白質組學

楊嘯吟，張一敏,2，朱立賢，毛衍偉，董鵬程，羅 欣,2,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

肉色能夠直觀地反映肉品的新鮮度和衛生狀況，是影響消費者購買欲望的最重要指標[1]。根據聯合國糧食及農業組織2016年報道[2]，失色是導致消費者拒絕購買食用肉制品的主要原因，給肉品的生產和銷售帶來了巨大浪費，僅美國肉類行業每年就會因產品的失色問題造成高達10億 美元的經濟損失。

氣調包裝技術可以通過改變肉品原有貯藏環境中的氣體成分保護良好肉色并抑制微生物的生長，是一種被廣泛用來改善產品肉色的有效手段。目前全球市場上最流行的氣調包裝方式是采用體積分數80% O2配合20%CO2的高氧氣調包裝。高氧環境可以促進肉的表面形成層次更深的氧合肌紅蛋白，使肉品呈現出誘人的鮮紅色，從而吸引消費者的購買。然而，肉品在高氧環境下長時間貯藏會加速氧合肌紅蛋白氧化成棕褐色的高鐵肌紅蛋白，導致貯藏后期肉品出現褐變失色現象[3]。

良好肉色的維持主要取決于肉色是否穩定，通常高鐵肌紅蛋白還原能力（metmyoglobin reductase activity，MRA）和氧氣消耗率（oxygen consumption rate，OCR）是決定肉色穩定性的關鍵指標[4]。在肉品成熟過程中，涉及糖酵解、線粒體代謝活性的一些肌漿蛋白會影響肉中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、抗氧化物質的含量以及高鐵肌紅蛋白還原酶的活性，進而影響肉品的MRA、OCR[5-6]?；陔p向電泳技術（two-dimensional electrophoresis，2DE）的蛋白質組學分析可以很好地分離并識別肌肉向肉品轉變過程中那些發生變化的差異蛋白，是研究肌肉宰后代謝進程的有力工具，然而目前有關肉色蛋白質組學的研究還多集中于比較不同部位肉的肉色穩定性差異上[6-8]，而且這些研究多為觀測宰后初期的蛋白表達量變化，對于長期貯藏過程中包裝方式對肉色影響的蛋白質組學分析卻鮮有報道。

從蛋白質組學的角度來探究貯藏期間高氧氣調包裝牛排肉色穩定性發生變化的原因，尋找與肉色相關的潛在蛋白質生物標簽，可以更好地了解高氧氣調包裝的護色機理，為控制貯藏后期的肉品失色問題提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的腰背最長肌均購自山東某肉牛屠宰企業的4 頭魯西黃牛（26～30 月齡，286～315 kg 胴體質量，極限pH值為5.5～5.7），胴體在2～4 ℃下排酸48 h，然后取整塊西冷部位并真空包裝，將樣品置于冰上迅速運回實驗室進行分割。

甘油、亞硝酸鈉、甲醇、磷酸 天津市凱通化學試劑有限公司；尿素、甘氨酸、硫脲、二硫蘇糖醇（1,4-dithiothreitol，DTT）、3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、溴酚藍、瓊脂糖、考馬斯亮藍 北京索萊寶科技有限公司；IPG干膠條（24 cm，pH 3～10） 美國通用電氣醫療集團；非干擾型蛋白濃度測定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DT-6D氣調包裝機 中國大江機械設備有限公司；C200真空包裝機 德國莫迪維克包裝設備有限公司；SP62便攜式色差計 美國愛色麗儀器有限公司；T18高速分散機 德國艾卡儀器設備有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國艾本德有限公司；Ettan IPGphor III等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳儀、ImageScanner III圖像掃描儀 美國通用醫療集團；5800基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of f l ight/time of f l ight，MALDI-TOF/TOF）質譜儀 美國SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品包裝

在實驗室將所有腰背最長肌分切成標準的2.54 cm牛排，然后隨機放入包裝盒內進行80% O2＋20% CO2（以體積分數計）高氧氣調包裝，頂隙空間比為3∶1，每個貯藏時間點有8 塊獨立包裝牛排作為重復實驗單元。將所有包裝放入2 ℃冷庫黑暗貯藏15 d，分別在第5、10、15天取出包裝并測定牛排的肉色指標，進行蛋白質組學分析。包裝前隨機取出8 塊牛排測定以下各項指標作為第0天的初始指標。

1.3.2 肉色常規指標測定

第0天的牛排2 ℃下暴露于空氣中發色30 min后測定肉色，貯藏第5、10、15天的牛排在打開各自包裝后立即用便攜式色差計測定牛排的亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）。按照式（1）計算色彩飽和度。每個樣品重復測量6 次，取其平均值。

高鐵肌紅蛋白相對含量（即高鐵肌紅蛋白占總肌紅蛋白的相對比例）的測定參照文獻[9]。色差計記錄下400～700 nm波長之間所有間隔10 nm的反射率，根據線性關系計算出525 nm和572 nm波長處的反射率（R值），其對應的吸收散射系數（K/S）根據Kubelka-Munk公式（K/S=（1?R）2/（2R））計算得出，再根據K/S在572 nm與525 nm波長處的比值計算出高鐵肌紅蛋白相對含量。

1.3.3 MRA測定

MRA測定參考Sammel等[10]提出的方法稍作改進。在牛排中央位置取2.54 cmh2.54 cmh2.54 cm立方體肉樣（無結締組織和脂肪），沿牛排展示面方向將立方體一分為二，上層肉樣正面朝上浸泡在50 mL 3 g/L NaNO2溶液中，室溫放置20 min，然后取出肉樣，用濾紙擦干肉樣表面的NaNO2溶液，真空包裝，立即測量肉樣表面的反射率，計算此時的高鐵肌紅蛋白相對含量（即初始高鐵肌紅蛋白相對含量）；真空包裝的肉樣30 ℃下放置2 h，再次測定肉樣表面的反射率，每次掃描3 次，計算高鐵肌紅蛋白相對含量（最終高鐵肌紅蛋白相對含量）。MRA的計算見式（2）。

1.3.4 OCR測定

參考Madhavi等[11]提出的方法稍作改進。將下層肉樣鮮切面朝上在2 ℃空氣中發色30 min，真空包裝后直接用色差計掃描，并參考文獻[9]計算初始氧合肌紅蛋白相對含量，然后將包裝肉樣在30 ℃下放置30 min，再次掃描并計算氧合肌紅蛋白相對含量（最終氧合肌紅蛋白相對含量），每次掃描3 次。OCR的計算見式（3）。

1.3.5 蛋白質組學分析

1.3.5.1 肌漿蛋白的提取

取2 g牛肉樣品，按1∶5（m/V）的比例加入提取液（40 mmol/L Tris-base、2 mmol/L EDTA，調pH值至8.0）、120 μL 2 mol/L DTT，冰浴勻漿，4 ℃下15 000hg離心20 min，取上清液即為肌漿蛋白，分裝凍藏（－80 ℃）備用。

1.3.5.2 一向等電聚焦

等電聚焦前，先用非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定樣品的蛋白濃度，然后對IPG干膠條進行上樣水化，上樣量為800 μg。采用Ettan IPGphor Ⅲ聚焦儀對泡脹好的膠條進行一向等電聚焦，設定聚焦程序為：300 V/1 h；1 000 V/1 h；grd 4 000 V/1 h；10 000 V/2.5 h；grd 10 000 V至80 000 V?h；grd 300 V/10 h。

1.3.5.3 二向聚丙烯酰氨凝膠電泳

聚焦結束后，分別用含10 g/L DTT和45 g/L IAA的膠條平衡緩沖液（含6 mol/L尿素、20 g/L SDS、體積分數30%甘油、體積分數0.002%溴酚藍）各4 mL去平衡膠條15 min。將平衡好的IPG膠條轉移到125 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠上端，將電泳緩沖液倒入電泳槽中。設置電泳儀參數：100 W電泳1 h，然后300 W下電泳約5 h，直到溴酚藍到達凝膠底部后關閉電泳，用考馬斯亮藍染色液對凝膠染色。

1.3.5.4 圖像掃描與質譜識別

將染色后的凝膠取出放入脫色液（體積分數1%冰醋酸）中搖晃脫色，多次更換脫色液至蛋白點清晰可見，通過圖像掃描儀對脫色后的凝膠進行掃描獲得圖譜，尋找差異蛋白質點。采用質譜儀對差異蛋白進行質譜檢測，主要操作過程為：切膠→膠內酶解→ZipTip脫鹽→抽提酶解肽段→MALDI-TOF/TOF質譜鑒定。最后用UniProt數據庫對質譜數據進行檢索，識別差異蛋白的種類。

1.4 數據分析

采用SSPS 18.0數據統計分析軟件進行單因素方差分析，并計算Pearson相關系數，P＜0.05表示差異顯著。數據結果用平均值±標準差表示。使用PDQuest軟件對不同貯藏時間組之間的同類蛋白進行圖譜匹配，并分別將第5、10、15天的蛋白質豐度與第0天相對應的蛋白質豐度進行比較，兩組間蛋白豐度相差1.5 倍以上且有顯著差異（P＜0.05）的蛋白點為差異蛋白點。

2 結果與分析

2.1 貯藏期間高氧氣調包裝冷卻牛排肉色指標變化

如表1所示，牛排的L*值在貯藏的0～10 d內顯著升高（P＜0.05），并在貯藏后期一直維持較高的穩定水平，說明高氧氣調包裝可以賦予牛排較好的亮度。貯藏前期，牛排具有較高的a*值和色彩飽和度，這主要是由于氧合肌紅蛋白的大量形成以及肉品具有較高的肉色穩定性，但貯藏5 d后二者隨貯藏時間延長快速下降（P＜0.05）。b*值在15 d內也表現出類似于a*值先增高后降低的變化趨勢。伴隨著a*值和色彩飽和度的下降（貯藏5～15 d內），貯藏期間牛排的高鐵肌紅蛋白相對含量隨貯藏時間延長顯著升高（P＜0.05），這些都預示著牛排的肉色穩定性不斷降低，失色現象正在逐漸發生。Estévez[12]的研究表明高氧環境會損耗并破壞肉中的還原系統，促使氧合肌紅蛋白氧化成為高鐵肌紅蛋白，從而加速了牛排的褐變速率。

表1 貯藏期間高氧氣調包裝冷卻牛排的肉色指標變化Table1 Changes in meat color traits of HiOx-MAP steak during chilled storage

2.2 貯藏期間高氧氣調包裝牛排MRA和OCR的變化

圖1 貯藏期間高氧氣調包裝冷卻牛排MRA和OCR變化Fig.1 Changes in MRA and OCR of HiOx-MAP steak during chilled storage

MRA是指肉中的還原系統把高鐵肌紅蛋白還原成脫氧肌紅蛋白的能力，通常肉色穩定性與MRA之間存在較高的正相關性[13]。OCR是指肉中線粒體消耗氧氣的速率，成熟過程中肉品內部的線粒體活性會不斷降低而且其形態也會發生改變，進而導致OCR的下降，肉色穩定性也隨之降低[13]。由圖1可知，貯藏期間牛排的MRA隨時間延長而快速降低（P＜0.05），這可能引發了高鐵肌紅蛋白的大量積累，從而導致高氧氣調包裝牛排在貯藏后期a*值和色彩飽和度的快速下降；貯藏期間牛排OCR也顯著下降（P＜0.05），有研究表明線粒體的結構在較高的氧氣濃度下會遭到破壞，例如，一些脂質氧化產物就能破壞線粒體的膜結構，進而降低其活性[14]。高氧氣調包裝牛排的肉色穩定性在貯藏后期出現快速下降，這可能與高氧環境加速了肉中MRA和OCR的下降有關。

2.3 貯藏期間高氧氣調包裝牛排的肌漿蛋白變化

通過質譜，本研究共鑒定出20 個可信度大于95%的差異蛋白質點，這些蛋白點在凝膠圖像中的位置如圖2所示，與之對應的蛋白名稱、檢索號、分子質量、等電點、蛋白得分、肽段數、序列覆蓋率和差異倍數如表2所示。這些差異蛋白質主要是一些代謝酶類、伴侶蛋白、結構蛋白、抗氧化蛋白和轉運蛋白等，其中代謝酶類是最主要的蛋白質種類。共發現了8 種代謝酶，其中4 種酶類主要參與了糖酵解進程，包括果糖-二磷酸醛縮酶、丙酮酸激酶（點6624和點4422）、3-磷酸甘油醛脫氫酶和果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2，還發現了參與三羧酸循環代謝的蘋果酸脫氫酶和黃素還原酶，這些酶類的蛋白表達量隨貯藏時間的延長出現了不同程度的下調。對于結果中出現的同一種蛋白對應不同蛋白點的現象，在其他文獻中也都有類似報道，其可能是蛋白翻譯后的修飾現象（磷酸化、乙?；龋?、不同蛋白亞型的存在，以及蛋白質的碎片化等導致的[15-17]。在動物宰后肌肉向肉品轉化的過程中，肌肉中的生化反應和能量代謝并沒有立即停止，而是進行糖酵解等代謝途徑，并伴隨著NADH和少量ATP的生成。在這一過程中，糖酵解酶和一些能量代謝酶類的活性通常會影響宰后肌肉的顏色、嫩度以及保水性等，對肉的品質具有決定性作用[15,17-18]。

圖2 貯藏期間高氧氣調包裝冷卻牛排2DE差異蛋白點標記Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) of differentially abundant proteins in HiOx-MAP steak during chilled storage

本研究還檢測出了兩種熱休克蛋白，熱休克蛋白是細胞內最重要的伴侶蛋白，可以在蛋白質水解過程中使破損的蛋白重定向，并可以保護、維持并修復細胞內一些重要蛋白質分子的功能性構象，還能調節蛋白穩定性及激酶活性，具有抗氧化損傷和抗細胞凋亡的保護作用[19]；DJ-1蛋白則是另一種對氧化還原敏感的伴侶蛋白，可保護神經元免于氧化應激和細胞死亡[20]。此外，檢測到的抗氧化蛋白2則是一種在生物體內普遍存在的抗氧化酶，它們可以通過硫氧還蛋白對體內代謝產生的氧化物或超氧化物進行還原，清除氧自由基，因而具有抗氧化的生理作用[21]。以上這些蛋白的表達量發生顯著變化，尤其是抗氧化蛋白2、DJ-1蛋白（點3101）和熱休克蛋白的表達量在貯藏后期出現上調，其原因可能是高氧環境誘發了牛排的氧化應激反應，通過激發機體自身的抗氧化系統來抵御氧化應激所帶來的損傷，進而起到減緩肌紅蛋白氧化的作用。

表2 貯藏期間高氧氣調包裝冷卻牛排的差異蛋白質信息Table2 Identi fi ed differentially expressed proteins in HiOx-MAP steak during chilled storage

2.4 高氧氣調包裝牛排貯藏期間與肉色相關的潛在蛋白質生物標簽

表3 高氧氣調包裝冷卻牛排貯藏期間差異蛋白質表達量與肉色指標的相關性Table3 Correlations between differentially abundant proteins in HiOx-MAP chilled steak and different meat color traits

如表3所示，貯藏過程中有15 個差異蛋白與高氧氣調包裝牛排肉色指標密切相關，這些蛋白主要是一些代謝酶類、伴侶蛋白、抗氧化蛋白以及肌紅蛋白。其中丙酮酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、熱休克蛋白、肌紅蛋白都與常規肉色指標a*值或色彩飽和度有顯著的相關性，是反映牛排肉色穩定性變化的重要潛在蛋白質生物標簽。作為糖酵解過程中最后一個酶也是主要的限速酶之一[22]，丙酮酸激酶的表達量與a*值和色彩飽和度值呈正相關性，且丙酮酸激酶（4422）與二者顯著相關。3-磷酸甘油醛脫氫酶的表達量與a*值、MRA、OCR都呈極顯著正相關（P＜0.01），與高鐵肌紅蛋白相對含量則呈極顯著負相關（P＜0.01），這種酶也是參與糖酵解進程的關鍵酶，它通過催化3-磷酸甘油醛的氧化磷酸化來影響糖酵解代謝速率，并調控著NADH的生成[23]。NADH對于高鐵肌紅蛋白的還原必不可少，高鐵肌紅蛋白還原酶通過NADH傳遞電子給高鐵肌紅蛋白，使得高鐵肌紅蛋白中的三價鐵離子還原成二價鐵離子[13]。此外，肌紅蛋白的表達量與a*值、MRA、OCR呈顯著或極顯著正相關，Wu Wei等[6]在研究托盤包裝牛排肉色相關蛋白變化時也有類似報道。Canto等[15]發現相較于肉色穩定性差的牛排，肌紅蛋白表達量在肉色更穩定的牛排中得到上調，并指出透氧托盤包裝貯藏過程中肌紅蛋白的降解可能會導致其表達量下調，進而降低了肉色穩定性。因此，高氧氣調包裝貯藏過程中，肉色穩定性的降低可能與肌紅蛋白的表達量下調有關。熱休克蛋白表達量與a*值和色彩飽和度值顯著或極顯著負相關，與MRA、OCR極顯著正相關，牛排在貯藏后期出現的熱休克蛋白表達量上調現象（表2），可能是機體通過熱休克蛋白來抵御氧化損傷的結果。

研究還發現，在代謝酶中，果糖-二磷酸醛縮酶、果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2、黃素還原酶、蘋果酸脫氫酶以及14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶與牛排的MRA和OCR呈顯著的正相關性（P＜0.01）。其中果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2可催化果糖-1,6-二磷酸水解生成果糖-6-磷酸和磷酸，而果糖-1,6-二磷酸則是糖酵解過程中的重要中間反應物[24]。果糖-二磷酸醛縮酶可以催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間發生可逆的羥醛裂解反應，也是參與糖酵解的重要酶類，牛肉成熟過程中果糖-二磷酸醛縮酶B的表達量下調已被其他學者證明[25]。鑒于糖酵解是NADH生成的重要途徑，貯藏期間果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2和果糖-二磷酸醛縮酶的表達量下調可能導致了肉中NADH的減少，從而降低了牛排的MRA，使牛排的肉色穩定性不斷降低。蘋果酸脫氫酶和黃素還原酶則分別是三羧酸循環中調控NADH和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinarnide adenine dinucleotide，NADPH）生成的關鍵酶，NADH和NADPH都對維持肉色穩定性至關重要[26]。另外，NADH作為線粒體電子傳遞鏈中的重要反應物與再生產物，其含量和氧氣攝入量顯著相關，較低的NADH含量會降低牛排的OCR[27]。目前關于14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶影響肉色的機理還尚不明確，但Joseph等[8]曾報道這種酶的表達量在肉色穩定的西冷部位要顯著高于其在肉色不穩定的里脊部位的表達量，說明14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶的表達量下調不利于維持肉色穩定。研究表明氧化環境導致的蛋白質氧化會造成一些酶原有功能的喪失，并降低其活性，另外，蛋白質在氧化過程中所發生的結構改變會使其變得更易被降解[28]；因此貯藏過程中高氧氣調包裝可能會降低牛排中這些參與糖酵解和三羧酸循環的代謝酶的表達量，進而降低NADH和NADPH的生成量，引發牛排的MRA和OCR快速下降，肉色穩定性也隨之降低。

貯藏期間，抗氧化蛋白2的表達量與高鐵肌紅蛋白相對含量呈顯著正相關性，與MRA和OCR則顯著負相關（P＜0.01），暗示著高氧氣調包裝可能會激發抗氧化蛋白2的表達量上調以達到保護機體免受氧化損傷的目的，從而緩解肌紅蛋白的氧化。DJ-1蛋白在細胞抵御氧化應激的反應中也發揮著關鍵作用[29]，Wu Wei等[30]發現貯藏中牛排的a*值、MRA與DJ-1蛋白表達量呈顯著的負相關性，并指出DJ-1蛋白可以作為指示貯藏后期肉品顏色變化的重要生物標簽。本實驗結果顯示，不同DJ-1蛋白亞型（點5117和點3101）的表達量與各肉色指標呈現出相反的相關性，其中點3101與高鐵肌紅蛋白相對含量、MRA和OCR之間表現出類似于抗氧化蛋白2的相關性，點5117則與高鐵肌紅蛋白相對含量呈極顯著負相關，與MRA和OCR極顯著正相關（P＜0.01）。有研究指出當肉品處于惡劣的貯藏環境中時，會促使DJ-1蛋白的表達量上調，但DJ-1蛋白會也在對抗氧化損傷的過程中不斷被消耗[20,29,31]。因此推測對于高氧氣調包裝牛排，DJ-1蛋白的表達量可能會隨時間延長出現先上升后下降的趨勢，其變化趨勢出現拐點的時間則由這種蛋白表達量的上調程度和自身被消耗的程度共同決定，這導致了不同DJ-1蛋白亞型的表達量與肉色指標的相關性并不一致。

3 結 論

貯藏過程中，高氧氣調包裝牛排的MRA和OCR隨貯藏時間延長而快速下降，這導致了牛排的a*值和色彩飽和度貯藏5 d后顯著降低，高鐵肌紅蛋白相對含量顯著升高，牛排的肉色穩定性不斷降低。通過蛋白質組學分析以及差異蛋白與各肉色指標之間的相關性分析，發現一些參與糖酵解和能量代謝的酶類、抗氧化蛋白、氧化應激相關的伴侶蛋白以及肌紅蛋白是涉及高氧氣調包裝牛排肉色穩定性變化的重要因素，可作為研究肉品褐變失色現象的潛在生物標簽。其中丙酮酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、果糖-二磷酸醛縮酶和果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2通過調節糖酵解進程來影響NADH的產生，而蘋果酸脫氫酶和黃素還原酶則通過調節三羧酸循環來影響NADH和NADPH的產生，貯藏期間這些酶表達量的下調可能減少了NADH和NADPH的產生，進而降低了牛排的MRA和OCR。還發現高氧氣調包裝貯藏過程中，肉色穩定性的降低可能也與肌紅蛋白的表達量下調有關。另外，抗氧化蛋白2、熱休克蛋白以及DJ-1蛋白的表達量也與肉色指標密切相關，高氧環境可能會引起肉品的氧化應激反應，從而促使這些蛋白表達量出現上調來保護機體免受氧化損傷，進而減緩肌紅蛋白的氧化。綜上所述，本研究所發現的蛋白標簽可以從機理上為解釋高氧氣調包裝肉品的肉色變化提供有意義的理論依據。