不同包裝方式下冷鮮青蝦的菌群多樣性分析

吳海虹，孫芝蘭*，張新笑，劉 芳，徐為民

（江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

青蝦，又名河蝦，廣泛分布于淡水水域，是一種高蛋白、低脂肪、營養價值極高的水產食品，頗受消費者青睞。然而，其水分和蛋白質含量較高，在捕撈、運輸、加工及貯藏過程中極易受細菌侵襲而腐敗變質[1-4]，不能適應市場流通銷售的需要。氣調包裝技術已在生鮮食品的保鮮包裝中廣泛應用[5-8]，勵建榮等[9]研究氣調包裝對冷藏魚糜制品品質的影響，得出體積分數50% CO2＋50% N2的氣調包裝比真空包裝和空氣包裝更有利于抑制魚丸中微生物的生長和延長魚丸的貨架期，藍蔚青等[10]認為體積分數80% CO2＋20% N2的氣調處理可將鯧魚樣品的冷藏貨架期延長至6～12 d，且發現氣調包裝與低溫結合可以顯著延長水產品的貨架期。

蝦在養殖、運輸及貯藏過程中污染微生物的種類復雜，導致其菌落結構呈現出多樣性。曹榮[11]、李蕾蕾[12]等研究了對蝦在貯藏過程中微生物菌相的變化，發現貯藏初期主要以假單胞菌和氣單胞菌為主，在冷藏后期希瓦氏菌的比例大大增加；但是青蝦在貯藏過程中微生物的菌群變化尚缺乏相關研究。因此研究不同包裝方式下青蝦的菌群結構及變化規律可為合理使用不同的保鮮技術提供理論依據。16S rDNA擴增子測序通常選擇某個或某幾個變異區域，利用保守區設計通用引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），然后基于HiSeq 2500 PE250平臺對高變區進行測序分析和菌種鑒定，測序深度高，更有利于低豐富群落物種的鑒定和提高微生物群落研究的完整性，可成為研究微生物群落多樣性的首選[13-14]。本實驗以青蝦為對象，通過16S rDNA V4區域擴增子測序分析，研究冷藏（4.0f0.5）℃條件下氣調包裝和空氣包裝方式對微生物菌群多樣性的影響，確定導致青蝦腐敗的優勢菌，為探索延長青蝦貨架期的保鮮工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蝦由溧陽市啟力潤食品有限公司提供。

肉湯培養基 北京陸橋公司；細菌基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；通用引物（515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[15]由北京諾禾致源公司合成。

1.2 儀器與設備

UniCen MR臺式冷凍離心機 德國Herolab公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；T-25數顯勻漿器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

隨機稱取20 kg的優質青蝦，加氧保活，在2 h內運至實驗室。到達實驗室后用碎冰猝死，經冰水沖洗后瀝水備用。迅速按要求進行包裝，每盒（150f5）g，本實驗選取兩種包裝方式：托盤包裝（以保鮮膜封口）和氣調包裝。氣調包裝取體積分數50% CO2，以N2作為補充氣體，氣體比例用氣體測定儀測定后進行充氣包裝。隨后將樣品置于4 ℃貯藏6 d，每天分別隨機取3 盒樣品測定細菌總數和揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量。

1.3.2 菌落總數的測定

按照GB 4789.2ü2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[16]的方法進行蝦仁樣品中菌落總數的測定。無菌環境下打開包裝盒，稱取25 g青蝦剪碎置于225 mL無菌生理鹽水中，均質器中速檔均質拍打1 min。取均質液依次10 倍梯度稀釋后，取合適的3 個連續梯度，傾注營養肉湯培養基，待凝固后于37 ℃倒置培養72 h。

1.3.3 TVB-N含量的測定

將青蝦絞碎攪勻，稱取約10 g加90 mL去離子水，振蕩浸漬30 min后過濾。取濾液5 mL參照GB/T 5009.228ü2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[17]測定TVB-N含量。

1.3.4 樣品總DNA的提取

取托盤包裝第2天和氣調包裝第4天的樣品，收集菌體，參照Hinton等[18]的方法提取總DNA。將青蝦剪碎放入裝有250 mL蛋白胨-生理鹽水（含1 g/L蛋白胨、8.5 g/L NaCl）的無菌均質袋中，振蕩器中200 r/min振蕩30 min。待振蕩結束后，2 000 r/min低溫離心5 min，去除蝦殼、肌肉等成分，再經0.22 μm濾膜過濾，收集濾膜上的菌體于無菌離心管中，12 000 r/min離心10 min收集菌體。利用細菌基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA。

1.3.5 16S rDNA測序及序列分析

16S rDNA V4區擴增子測序及分析委托諾禾致源公司進行，其步驟為：首先利用帶Barcode的特異性引物擴增16S rDNA的V4區。PCR產物經純化后，利用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和實時熒光定量PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

對于得到的有效數據，利用Uparse 7.0.1001軟件進行聚類[19]，默認以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。對OTUs代表序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILV的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0）[20]。使用MUSCLE 3.8.31軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系[21]。最后對各樣品的數據進行均一化處理，利用均一化的數據進行Alpha和Beta多樣性分析。其中，使用R 2.15.3軟件繪制稀釋物種多樣性曲線和主坐標分析（principal co-ordinates anyalysis，PCoA）圖。

1.4 數據處理

利用統計學軟件SPSS 17.0單因素方差分析對數據進行顯著性比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同包裝方式對青蝦貯藏過程中菌落總數的影響

圖1 不同包裝方式對青蝦貯藏過程中菌落總數的影響Fig.1 Change in total viable count under different packaging treatments

細菌的數量是表示產品腐敗程度的重要指標，青蝦在貯藏過程中菌落總數的變化如圖1所示。在兩種不同的包裝方式中，隨著貯藏時間的延長，菌落總數均逐漸增加。樣品初始菌落總數為5.59（lg（CFU/g）），托盤包裝組的菌落總數增長迅速，貯藏的第2天菌落總數已達6.27（lg（CFU/g）），而氣調包裝組菌落總數增長緩慢；在貯藏的第6天菌落總數為5.99（lg（CFU/g）），與托盤包裝組第1天時接近。在整個貯藏過程中，氣調包裝組樣品的菌落總數均顯著低于托盤包裝組（P＜0.05），說明CO2氣調包裝方式能有效延長青蝦的貨架期。

2.2 不同包裝方式對青蝦貯藏過程中TVB-N含量的影響

TVB-N是微生物進入肌肉組織內部，生長繁殖導致肌肉蛋白質分解而形成的產物，是評價產品新鮮度的一項重要指標[22]。在GB 2733ü2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》中規定淡水魚蝦TVB-N含量應不高于20 mg/100 g；因此，本實驗中分析了青蝦貯藏過程中TVB-N含量的變化，并將TVB-N含量為20 mg/100 g時定義為青蝦的貨架期。隨后取腐敗節點的樣品進行微生物多樣性分析，為后續青蝦貯藏過程中腐敗菌控制，進一步延長貨架期提供依據。

如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，兩種不同包裝方式的青蝦TVB-N含量均逐漸增加。在托盤包裝組青蝦在貯藏的前2 d，TVB-N含量由最初的12.7 mg/100 g增長至20.4 mg/100 g，而氣調包裝組青蝦在貯藏的第4天，TVB-N含量為21.3 mg/100 g。因此托盤包裝組和氣調包裝組的青蝦分別于貯藏的第2天和第4天到達腐敗節點，后續微生物菌群分析樣品分別取自托盤包裝的第2天和氣調包裝的第4天。

圖2 不同包裝方式對青蝦貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig.2 Changes in TVB-N content under different packaging treaments

2.3 基于16S rRNA基因測序的物種多樣性

取初始樣品、托盤包裝組和氣調包裝組進入腐敗期的樣品，進行16S rRNA V4區測序。3 組樣品產生的有效片段數量在65 219～95 052之間，平均長度在250～257 bp之間，98.5%的堿基Q值大于20（即錯誤率小于1%）。在有效的片段數量中，初始樣品、托盤包裝組和氣調包裝組的GC含量分別為50.2%、51.2%和52.0%。對樣品中有效的Tags進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋，發現這3 組樣品中的菌群主要包含變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、互養菌門（Synergistetes）10 個優勢菌門。

2.4 物種相對豐度分析

選取各組在科、屬和種水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖（圖3）。由圖3可以看出，初始樣品、托盤包裝組和氣調包裝組樣品所含微生物種類和數量在科、屬和種水平均有差異。

圖3 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種的相對豐度Fig.3 Relative abundance of microbial species under different packaging treatments during storage

由圖3 A可知，初始樣品中支原體科Mycoplasmataceae所占比例最大，為42.4%，其次為莫拉菌科Moraxellaceae，所占比例為34.6%，黃桿菌科Flavobacteriaceae占3.5%；托盤包裝組中在科水平下主要有Moraxellaceae（25.0%）、Flavobacteriaceae（18.4%）、希瓦氏菌科Shewanellaceae（12.2%）、假單胞菌科Pseudomonadaceae（5.5%）、普雷沃氏菌科Prevotellaceae（6.0%）和毛螺菌科Lachnospiraceae（3.7%）；氣調包裝組的菌群在科水平下主要有Pseudomonadaceae（26.4%）、Moraxellaceae（14.6%）、鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae（7.6%）、Lachnospiraceae（3.8%）和疣微菌科Ruminococcaceae（3.3%）。從科水平來看，與初始樣品相比，托盤包裝組第2天科水平的豐富度增加，Flavobacterium、Shewanellaceae、假單胞菌科等一些嗜冷菌相對豐度增加。而與托盤包裝組相比，氣調包裝組假單胞菌科逐漸占據優勢，這可能是因為Flavobacterium、Shewanellaceae對低氧環境耐受能力更差，而假單胞菌科有更強的耐受力。

從屬水平來看（圖3B），初始樣品中優勢菌屬主要為嗜冷桿菌屬Psychrobacter（33.6%）和Candidatus Bacilloplasma（42%），兩者總豐度占75.6%。與初始樣品相比，托盤包裝組Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma的相對豐度大大減小，而假單胞菌屬（Pseudomonas）（5.5%）、Acinetobacter（13.9%）、Flavobacterium（12.3%）和希瓦氏菌屬（Shewanella）（12.2%）相對豐度顯著增加，聚類在其他的菌屬由19%增加至33.7%，也說明菌種的豐富度增加。與托盤包裝組相比，氣調包裝組假單胞菌屬（26.4%）豐度顯著增加，而Flavobacterium和Shewanellaceae相對豐度顯著降低。聚類在其他的菌屬已接近50%，氣調包裝使菌種的豐富度進一步增加。

從種水平來看（圖3C），初始樣品中優勢菌種主要為嗜冷桿菌屬，分別為Psychrobacter arenosus（19.1%）、Psychrobacter cryohalolentis（4.3%）和Psychrobacter maritimus（1.5%）。與初始樣品相比，托盤包裝組Psychrobacter相對豐度降低，Shewanella putrefaciens（11.8%）和Flavobacterium succinicans（8.0%）相對豐度顯著增加；氣調包裝組中優勢菌種主要為Pseudomonas veronii（26%）。說明氣調包裝抑制多數微生物的增殖，包括嗜冷菌和非嗜冷菌，但對假單胞菌的抑制效果不明顯，使其逐漸生長為優勢菌。

2.5 物種豐度聚類分析

圖4 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種豐度聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis of microbial species abundance under different packaging treatments during storage

選取豐度排名前35的屬，根據其在每個樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個層面進行聚類，繪制成熱圖，更便于發現哪些物種在哪些樣品中聚集較多或含量較低。如圖4所示，圖中顏色越深表示該物種聚集越多，可以看出3 組樣品物種聚集差異較大。在初始樣品組中，Psychrobacter、Candidatus Bacilloplasma和Planctomyces聚集較多，其他物種較分散；而在貯藏過程中，無論托盤包裝還是氣調包裝，均有物種出現了不同程度的聚集，但集中在不同的區間。在托盤包裝組中，Aeromonas、Flavobacterium、Shewanella等聚集較多，這可能與這些菌能耐受較低的溫度有關。氣調包裝組中Pseudomonas聚集較多，說明氣調包裝能抑制貯藏期中優勢腐敗菌如Flavobacterium和Shewanella的生長，但假單胞菌屬有較強的耐受力，從而逐漸生長為優勢菌株。

2.6 Ternary plot分析

圖5 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種的三元相圖Fig.5 Ternary plots of microbial species under different packaging treatments during storage

為了繼續尋找初始樣品、托盤包裝組和氣調包裝組3 組樣品之間優勢物種的差異，選取這3 組樣品在科、屬、種水平上平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖。從科水平看（圖5A），莫拉菌科Moraxellaceae在初始包裝組和托盤包裝組中有較大比例的富集，而在氣調包裝組中相對豐度較低，說明氣調包裝能抑制莫拉菌科的菌種生長。支原體科（Mycoplasmataceae）在初始樣品中所占比例最大，但托盤包裝組和氣調包裝組中比例接近都非常低，說明Mycoplasmataceae不能適應低溫環境，在低溫貯藏時將不會成為致腐的優勢菌株。Flavobacteriaceae和Shewanellaceae在初始樣品中比例較少，在托盤包裝組中所占的比例大大增加，說明二者能耐受較低的溫度，將會成為青蝦低溫貯藏時的主要威脅菌株。而在氣調包裝組中，二者的比例又大大降低，說明氣調包裝能顯著抑制二者的生長，這可能與它們的多數菌株不能耐受低氧環境有關。Pseudomonadaceae在初始樣品組和托盤包裝組中都未有較大比例的富集，但是在氣調包裝組中所占比例大大增加，說明氣調包裝不能有效控制Pseudomonadaceae菌株的生長，需要配合一些其他的殺菌技術（例如高壓靜電保鮮技術[23]）才能進一步延長貨架期。

從屬水平看（圖5B），3 組樣品中的優勢物種也差異較大，在初始樣品組中，與物種豐度分析結果一致，優勢物種為Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma，且相對豐度最高。在托盤包裝組中，Flavobacterium、Shewanella和Arthrobacter為優勢物種，但相對豐度相比初始樣品組已大大降低。在托盤包裝組中優勢物種主要為Pseudomonas和Sphingomonas，且Pseudomonas的相對豐度遠遠大于Sphingomonas。另外，Acinetobacter在托盤包裝組和氣調包裝組中都有一定程度的聚集。

從種水平看（圖5C），初始樣品中優勢菌種主要為Psychrobacter arenosus，且相對豐度較高。托盤包裝組中主要為Shewanella putrefaciens和Flavobacterium succinicans，同樣地，二者的相對豐度相對初始樣品組也大大降低。而在氣調包裝組中Pseudomonas veronii已占據了絕對優勢，其相對豐度遠遠大于其他物種。

2.7 屬水平物種進化樹

為了進一步研究屬水平物種的系統進化關系，通過多序列比對得到排名前100屬的代表序列的系統發生關系（圖6），可以看出，初始樣品組中優勢物種Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma主要集中在兩個不同的分支。在托盤包裝組中，雖然物種種類豐富度增加，但種與種之間的親緣關系較接近，依舊主要集中在兩個不同的分支。但在氣調包裝組中，物種的豐度大大降低，豐富度卻增加，散落在各個分支中。說明氣調包裝抑制了優勢腐敗菌的增長，從而使物種的豐富度增加。

圖6 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種的屬水平物種系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of microbial genera under different packaging treatments during storage

2.8 物種多樣性曲線

物種多樣性曲線可直觀反映樣品中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣品中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻。

圖7 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種多樣性曲線Fig.7 Rank abundance curves of microbial species under different packaging treatments during storage

由圖7可知，從物種的豐富度和均勻度來說都是初始樣品組＜托盤包裝組＜氣調包裝組，這與上述分析也較為一致，青蝦經過一定的貯藏期后，物種豐富度增加，物種分布較初始樣品均勻，而氣調包裝能抑制原本優勢腐敗菌的生長，造成物種的豐富度和均勻度進一步增加。

2.9 基于OTU的Venn分析

圖8 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種間共有OTU分析圖Fig.8 Shared OTU analysis of samples under different packaging treatments during storage

基于樣品總OTU數作Venn圖，進行相似性分析（圖8）。初始樣品組與托盤包裝組共有的OTU數735 個，占二者OTU總數的42.4%。初始樣品組中特有的OTU為102 個，托盤包裝組中特有的OTU為557 個，同樣也說明托盤包裝組中菌群結構豐富度和均勻度與初始樣品相比有所增加。氣調包裝組與托盤包裝組共有的OTU為851 個，占二者總數的35.8%，氣調包裝組中特有的OTU為744 個，說明氣調包裝組中菌群結構的豐富度和均勻度稍高于托盤包裝組，但二者的菌群結構差異較大。

2.1 0 物種主坐標PCoA分析

圖9 基于Weighted Unifrac距離的PCoA分析Fig.9 PCoA analysis based on the Weighted Unifrac distance

基于Weighted Unifrac距離進行PCoA分析，由圖9可知，初始樣品組、托盤包裝組和氣調包裝組3 組樣品分別聚集在不同的象限，說明這3 組樣品微生物群落結構存在顯著差異。初始樣品組的聚集性明顯高于托盤包裝組和氣調包裝組，說明初始樣品組樣品個體之間重復性高于另外兩組，即初始樣品組樣品中所含有的微生物群落多樣性較小。而托盤包裝方式下微生物群落多樣性增加，說明原始的優勢菌株不能耐受較低的貯藏溫度，而原本非優勢的耐低溫菌株快速生長，造成比例增大。托盤包裝優勢菌株聚集在第四象限而氣調包裝組聚集在第三象限，說明氣調包裝能抑制優勢腐敗菌-耐低溫菌株的生長，起到較好的保鮮作用。

3 討 論

本實驗通過對托盤包裝和CO2氣調包裝方式下青蝦菌群結構的深入分析，認識了青蝦貯藏過程中腐敗菌群的一般結構、優勢菌群及不同包裝方式對優勢菌群的影響，為進一步集成不同的冷鮮技術、延長貨架期提供理論依據。青蝦的初始菌落總數和TVB-N含量較高，分別為5.59（lg（CFU/g））和12.7 mg/100 g，托盤包裝2 d后，TVB-N含量已達到20.4 mg/100 g，已腐敗變質，因此通常青蝦的保鮮期比較短。采用氣調包裝后，貨架期延長至4 d，但相對于冷鮮肉來說貨架期仍然較短[24]。本實驗通過菌群結構分析顯示，從屬水平上看出，托盤包裝方式下優勢菌群主要以Acinetobacter、Flavobacterium和Shewanellaceae為主，因此這三者是造成青蝦腐敗的主要菌群。采用氣調包裝后，Flavobacterium和Shewanellaceae的豐度相對于托盤包裝大大降低，Flavobacterium為嚴格好氧菌[25-26]，50% CO2＋50% N2造成的無氧環境能顯著抑制二者的增殖。Shewanellaceae為兼性厭氧菌[27-28]，在氣調包裝方式下，其生長繁殖受到抑制，這可能與CO2溶解于樣品汁液中，所造成的低pH值有關[29-30]。因此50% CO2＋50% N2能抑制優勢腐敗菌的生長，延長貨架期。此外，氣調包裝增加了微生物菌群的多樣性，這可能也與氣調包裝抑制了普通托盤包裝時優勢腐敗菌的生長有關。環境中微生物互相競爭食物中的營養、溶解氧等物質，氣調包裝消除優勢腐敗菌的競爭，非優勢菌株開始生長繁殖，因而增加了菌群多樣性。在氣調包裝方式下，Pseudomonadaceae所占的比例為26.4%，成為新的優勢腐敗菌，這可能是因為Pseudomonadaceae有較強的耐受力。后期可研究與其他保鮮技術如高壓靜電保鮮技術[23]聯合以進一步延長青蝦的貨架期。