韓夢凡,蔣思睿,鐘舒睿,徐逸群,陶 陽,韓永斌*
(南京農業大學 農業部農畜產品加工與質量控制重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)
甘藍(Brassica oleracea var. capitata)為十字花科蕓薹屬蔬菜中的一種,含有較為豐富的膳食纖維、礦物質、多酚、抗壞血酸、硫代葡萄糖苷等營養和生物活性物質。大量研究表明,甘藍具有抗氧化、保護心臟、抗癌等多種生理功能[1-2]。相比于傳統的結球甘藍,水果甘藍為一種較新穎的甘藍品種,其具有較高的含糖量,質地清脆,適于鮮食和制作沙拉,因此受到了越來越多消費者的關注[3]。
將水果甘藍加工成鮮切產品,一般需要經過分級、清洗、切分、保鮮、包裝等一系列加工操作[4]。但是切割處理會導致甘藍組織產生機械損傷,正常的組織代謝被破壞,極易發生酶促褐變和微生物侵染、增殖,影響鮮切蔬菜的品質、貨架期和食用安全性。目前,關于鮮切蔬菜保鮮的研究較多,但是主要集中在花椰菜和青花菜,對結球甘藍保鮮的研究鮮見報道;因此亟須針對鮮切水果甘藍的保鮮和提高貯藏穩定性展開研究。
鮮切蔬菜的常用保鮮方式可分為物理保鮮、化學保鮮、生物保鮮。物理保鮮方式有低溫處理、輻射處理、超高壓處理、臭氧處理等。其中,臭氧殺菌速度較快且效果明顯,無二次污染,是非常有前景的一項新技術[5],已經廣泛應用于自來水消毒和食品的殺菌領域[6-7]。da Silva等[8]研究表明臭氧能有效保持卷心菜黃酮、VC、總葉綠素含量,并4 ℃貯藏下其貨架期延長了6 d。Alwi等[9]采用9 mg/L的臭氧氣體處理鮮切甜椒6 h后,大腸桿菌、沙門氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌群降低了2.89、2.56、3.06(lg(CFU/g))。化學保鮮方式有涂膜處理、保鮮劑處理等。植酸是一種天然的果蔬保鮮劑,可抑制鮮切蔬菜的氧化、褐變和衰老[10-11]。姜麗等[12]發現植酸浸泡處理可以抑制紫背天葵過氧化物酶活力,提高可溶性糖、可溶性蛋白的保留率,從而提高了其品質。生物保鮮是用有益微生物的代謝產物抑制有害微生物,從而達到延長鮮切蔬菜貨架期的目的。
近年來,不斷有研究表明,將不同的保鮮技術進行組合后可增強鮮切蔬菜的保鮮效果。Song Zunyang等[13]發現乳酸鏈球素和殼聚糖涂膜聯合處理能有效抑制鮮切胡蘿卜抗壞血酸含量下降和腐敗微生物生長,并增加其總酚含量。Bari等[14]在甘藍和花椰菜苗上接種單增李斯特菌,用乳酸鏈球菌素處理、植酸處理、乳酸鏈球菌素和植酸進行聯合處理,研究發現,聯合處理比單獨乳酸鏈球菌素處理和單獨植酸處理的殺菌效果更好。目前,將臭氧和植酸聯合用于鮮切蔬菜的保鮮研究鮮見報道。
因此,本實驗分別采用臭氧、植酸浸泡,以及臭氧聯合植酸的方式處理鮮切水果甘藍,研究經過保鮮處理的鮮切水果甘藍在低溫貯藏過程中生理生化特性的變化規律,包括可溶性糖、可溶性蛋白、抗壞血酸和總酚含量,過氧化物酶(peroxidase,POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力,硫苷成分及異硫氰酸鹽的含量,在此基礎上探究鮮切水果甘藍的合理保鮮方式。
成熟水果甘藍由江蘇省農科院蔬菜研究所提供,于2016年11初采自江蘇省農科院蔬菜種植基地,品種為‘甜味55號’。采摘后水果甘藍立即貯藏于4 ℃冷庫中,24 h內處理。
植酸(分析純)、1,2-苯二硫醇(分析純)廣東省化學試劑工程技術研究開發中心;羧甲基纖維素鈉(化學純) 國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸(標準品)、沒食子酸(標準品)、SOD試劑盒上海源葉生物科技有限公司;丙烯基硫苷(分析標準品)美國Sigma公司。
UV-2450型紫外-可見分光光度計、LC-30AD液相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司;TDL-40B離心機 上海安亭科學儀器廠;1200高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀美國安捷倫公司;IKA A11小型冷凍粉碎機 德國IKA公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;W-H臭氧發生器、臭氧檢測器 南京沃環科技實業有限公司。
1.3.1 鮮切水果甘藍的保鮮處理
選取新鮮、無損傷的水果甘藍,剝去外部兩層葉子后,依次選取第3~9層的葉片進行處理。先用蒸餾水清洗,然后切分成2 cmh5 cm的葉片,每次取100 g樣品,分別在室溫下(25 ℃)進行臭氧處理、植酸浸泡、臭氧聯合植酸處理。臭氧處理組:將切分后的水果甘藍置于含有30 mg/L臭氧的密閉容器內15 min。植酸浸泡組:將切分后的水果甘藍在0.5 mmol/L的植酸溶液(1∶10,m/V)中浸泡10 min,結束后擦去表面溶液。臭氧聯合植酸處理組:將在0.5 mmol/L植酸溶液(1∶10,m/V)中浸泡10 min后的水果甘藍取出,先擦去表面溶液,然后置于含30 mg/L臭氧的密閉容器內,15 min后取出。以不進行任何保鮮處理的水果甘藍作為對照樣品,每個處理均重復3 次。
保鮮處理后,將水果甘藍密閉包裝在市售聚乙烯保鮮袋中,于4 ℃黑暗貯藏。分別在貯藏第0、2、4、6、8天取樣分析水果甘藍的生理生化特性。取樣時部分樣品冷凍干燥后打粉,用于水果甘藍中可溶性糖、可溶性蛋白、抗壞血酸、總酚、硫苷、異硫氰酸鹽含量的測定。其余新鮮樣品用于菌落總數、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)、過氧化氫酶(catalase,CAT)活力的測定。
1.3.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量的測定
可溶性糖含量采用蒽銅-硫酸法測定[15],可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定[16],單位均為mg/g,結果以干質量計。
1.3.3 抗壞血酸含量測定
抗壞血酸的測定參考Volden等[17]的方法。取0.1 g甘藍凍干粉,用4 mL體積分數2%草酸溶液充分研磨勻漿后,10 000 r/min離心15 min得上清液,過0.45 μm水系膜,HPLC待測。HPLC條件:SB-C18色譜柱(250 mmh4.6 mm,5 μm);檢測波長254 nm;流速0.8 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;流動相A為體積分數0.1%草酸溶液,流動相B為甲醇,體積比為95∶5。抗壞血酸含量單位為mg/g,結果以干質量計。
1.3.4 總酚含量測定
總酚含量測定參考Singleton等[18]的方法,略加改動。取甘藍凍干粉0.1 g,用5 mL、體積分數50%甲醇溶液充分研磨勻漿后,10 000 r/min離心15 min得上清液。取0.5 mL上清液與1 mL Folin-酚溶液(0.1 mol/L)避光靜置5 min,再加入1.5 mL質量分數7.5% Na2CO3溶液混勻,在室溫下黑暗反應1.0 h,于765 nm波長處測定吸光度。采用沒食子酸標品建立標準曲線,總酚含量單位為mg/g,結果以干質量計。
1.3.5 POD活力的測定
POD活力的測定參考Chen Yulong等[19]的方法并略作改動。取5 g鮮切水果甘藍,加入0.1 g聚乙烯吡咯烷酮、20 mL磷酸鈉緩沖液(pH 6.4),冰浴充分研磨后,4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min,取上清液低溫留存備用。
取0.5 m L上清液,與2 m L愈創木酚溶液(50 mmol/L)混勻后30 ℃水浴5 min。然后加入1 mL、體積分數0.08% H2O2溶液,室溫下反應3 min,每30 s記錄460 nm波長處的吸光度。以每克樣品每分鐘在460 nm波長處吸光度變化0.1為1個酶活力單位,單位為U/g,結果以鮮質量計。
1.3.6 SOD活力的測定
取0.5 mL 1.3.5節中提取出的酶液,用SOD試劑盒進行測定。以每克組織在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1 個酶活力單位,單位為U/g,結果以鮮質量計。
1.3.7 CAT活力的測定
CAT活力的測定參考文獻[20]。取5.0 g鮮切水果甘藍,加入0.1 g聚乙烯吡咯烷酮、20 mL磷酸鈉緩沖液(pH 7.5),冰浴上充分研磨后,4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min,取上清液低溫留存備用。取3 mL H2O2(20 mmol/L)與0.5 mL上清液進行反應,室溫下反應3 min,每30 s記錄240 nm波長處的吸光度。以每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1 個酶活力單位,單位為U/g,結果以鮮質量計。
1.3.8 PAL活力的測定
PAL活力的測定參考文獻[21]。取3 mL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L,pH 7.5)與0.5 mL L-苯丙氨酸(20 mmol/L)混勻,在37 ℃預保溫平衡10 min,加入0.5 mL 1.3.7節中提取的酶液,立即在290 nm波長處測定吸光度;置37 ℃保溫60 min后,再測其吸光度。以每克果蔬樣品每小時吸光度增加0.01為1個酶活力單位,單位為U/g,結果以鮮質量計。
1.3.9 硫代葡萄糖苷成分的鑒定及分析
參考Palani等[22]的方法,略加改動。取0.1 g甘藍凍干粉,加入4 mL體積分數70%的甲醇,在70 ℃條件下水浴20 min,冷卻至室溫,10 000 r/min離心15 min得上清液。再用2 mL體積分數70%的甲醇溶液重復提取1 次,合并兩次所得上清液。將上清液旋轉蒸發至只剩干物質,用1 mL體積分數0.05%的三氟乙酸溶解,過0.45 μm水系膜,HPLC待測。
液相色譜-質譜聯用儀的分析條件為:色譜柱:C18柱(100 mmh2.1 mm,3 μm),流動相A為10 mmol/L甲酸銨,流動相B為乙腈,洗脫條件:0~3~25~30~37~37.10 min,流動相B 5%(體積分數,下同)~80%~90%~90%~5%,流速:0.4 mL/min;檢測波長226 nm。
液相色譜分析條件為:X D B-C18色譜柱(250 mmh4.6 mm,5 μm);檢測波長227 nm;流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;流動相三氟乙酸(體積分數0.05%)-乙腈,洗脫梯度時間為0~15~25~40~50~55~60 min,乙腈線性梯度為0%~0%~5%~20%~35%~99%~0%。用丙烯基硫苷、1-磺酸-3-吲哚甲基硫苷、4-甲基硫氧丁基硫苷建立標準曲線,硫代葡萄糖苷含量單位為mg/g,結果以干質量計。
1.3.10 異硫氰酸鹽含量的測定
異硫氰酸鹽含量的測定參考文獻[23]。取0.1 g甘藍凍干粉,用4 mL蒸餾水充分研磨,37 ℃水浴2 h后10 000 r/min離心15 min得上清液。取250 μL上清液,與250 μL磷酸鉀緩沖液(0.1 mol/L,pH 8.5)、0.5 mL 1,2-苯二硫醇(10 mmol/L)混勻后,在65 ℃反應2 h。過0.45 μm有機膜,進行HPLC分析,采用蘿卜硫素建立標準曲線。HPLC條件:色譜柱為XDB-C18柱(150 mmh4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇-水(70∶30,V/V);流速1.00 mL/min;進樣量20 μL;檢測波長365 nm,單位為μmol/100 g,結果以干質量計。
1.3.11 菌落總數測定
菌落總數參考GB 4789.2ü2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[24]測定。
以上實驗均重復均3 次,結果以平均值±標準差的形式表示,采用SPSS 20.0進行最小顯著性差異分析,P<0.05表示差異顯著。

圖1 不同處理對鮮切水果甘藍貯藏過程中可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響Fig.1 Effects of different treatments on the contents of soluble sugar (A)and soluble protein (B) in fresh-cut fruit cabbage during storage
由圖1A可知,鮮切水果甘藍中可溶性糖含量在低溫貯藏過程中總體呈下降趨勢,但是不同保鮮方式處理后的可溶性糖含量明顯高于對照組。貯藏過程中可溶性糖為水果甘藍呼吸作用的底物,在貯藏過程中被不斷消耗,所以呈下降趨勢。貯藏8 d后,對照組樣品可溶性糖含量由初始的446.62 mg/g降至302.70 mg/g,可溶性糖保留率為67.78%;臭氧處理組、植酸浸泡處理組以及臭氧聯合植酸處理組在貯藏8 d后,樣品可溶性糖保留率分別為77.79%、77.27%和81.44%,其中臭氧聯合植酸處理效果最好,可溶性糖含量是對照組的1.21 倍。姜麗等[12]發現植酸浸泡方式處理可以提高紫背天葵可溶性糖的保留率,Tzortzakis等[25]的研究表明臭氧處理有效維持了非結構性碳水化合物組分,提高了番茄的可溶性糖保留率。同時由可溶性糖含量的變化可知,臭氧處理與植酸處理聯合作用效果比單獨處理效果更好。
由圖1B可知,不同條件處理后的鮮切水果甘藍中可溶性蛋白含量在低溫貯藏過程中整體上均呈下降趨勢。同時不同處理組樣品中可溶性蛋白含量整體上均高于對照組樣品。貯藏8 d后,對照組樣品可溶性蛋白含量由4.98 mg/g降至3.07 mg/g,損失了38.35%。臭氧、植酸浸泡、臭氧聯合植酸處理組的樣品可溶性蛋白含量分別為3.67、3.53 mg/g和3.95 mg/g,臭氧聯合植酸處理組的可溶性蛋白含量是對照組的1.28 倍。由此可見,臭氧聯合植酸處理更利于鮮切水果甘藍可溶性蛋白在貯藏過程中的保留。

圖2 不同處理對鮮切水果甘藍貯藏過程中抗壞血酸(A)和總酚(B)含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on the contents of ascorbic acid (A)and total phenolics (B) in fresh-cut fruit cabbage during storage
與可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化規律相似,不同處理組鮮切水果甘藍中抗壞血酸含量在貯藏過程中不斷降低(圖2A)。在貯藏的前2 d,4 組鮮切水果甘藍抗壞血酸含量下降都比較迅速,可能是由于水果甘藍經切分處理后,抗壞血酸與氧氣接觸,導致抗壞血酸被迅速氧化。同時,臭氧、植酸浸泡以及臭氧聯合植酸處理提高了貯藏過程中抗壞血酸的保留率,可能是由于臭氧抑制了抗壞血酸過氧化物酶和抗壞血酸氧化酶的活力[26],延緩了VC的降解;且植酸具有抗氧化性[12],能有效防止VC的損失。3 種不同保鮮處理方式下的水果甘藍中抗壞血酸含量在不同貯藏階段差異不顯著。
酚類物質是水果甘藍中重要的生物活性物質,總酚含量在貯藏過程中的變化如圖2B所示。貯藏前2 d,對照組總酚含量顯著下降,其余處理組樣品總酚含量無明顯變化。貯藏前6 d,臭氧聯合植酸處理可顯著提高鮮切水果甘藍中酚類物質的保留率。臭氧聯合植酸處理組樣品在貯藏第2、4天的總酚含量為1.79 mg/g和2.66 mg/g,分別比相同貯藏時間的對照組高68.86%和46.15%,因此臭氧聯合植酸處理能在貯藏前4 d有效提高總酚含量。酚類物質的積累與PAL活力相關,臭氧聯合植酸處理后可能激活鮮切水果甘藍中PAL活力,促進酚類物質的合成[26]。

圖3 不同處理鮮切水果甘藍貯藏過程中POD(A)、SOD(B)、CAT(C)、PAL(D)活力的影響Fig.3 Effects of different treatments on POD (A), SOD (B), CAT (C)and PAL (D) activities in fresh-cut fruit cabbage during storage
POD在酶促氧化過程中起到重要作用,POD活力越高,褐變程度越高。SOD、CAT可在植物體中相互協調配合,清除過剩的自由基,使體內自由基維持在正常的動態水平,以提高植物的抗逆性[25]。由圖3A可知,貯藏前2 d,臭氧、植酸浸泡、臭氧聯合植酸處理組中POD活力均高于對照組。對照組樣品POD活力在整個貯藏過程中不斷提高,而其他3種處理組樣品POD活力無明顯變化規律。貯藏的第8天,臭氧、植酸浸泡、臭氧聯合植酸處理組水果甘藍POD活力均顯著低于對照組,表明植酸與臭氧處理能有效延緩鮮切水果甘藍的褐變,且臭氧聯合植酸處理效果優于各單獨處理。
由圖3B可知,不同方式處理的鮮切水果甘藍SOD活力變化在貯藏過程中無明顯變化規律。但是在貯藏的第8天,臭氧聯合植酸處理組的鮮切水果甘藍SOD活力略微高于對照組,推測此時經臭氧和植酸處理的鮮切水果甘藍抗氧化能力稍強于對照組。由圖3C可知,鮮切水果甘藍中CAT活力整體呈上升趨勢,且保鮮處理組CAT活力在貯藏過程中整體上低于對照組。
PAL是酚類物質合成的關鍵酶,催化苯丙氨酸向酚類物質轉化,可提高果蔬總酚的含量。由圖3D可知,貯藏4 d后,臭氧處理組、臭氧聯合植酸處理組的樣品以及對照組樣品中PAL活力在貯藏過程中均呈現上升趨勢。貯藏至第8天,臭氧處理組(84.50 U/g)、臭氧聯合植酸處理組(85.05 U/g)的鮮切水果甘藍PAL活力均高于對照組樣品(69.07 U/g)。
硫代葡萄糖苷(硫苷)廣泛存在于十字花科蔬菜中,是一種重要的次生代謝產物。當植物受到損傷時,植物細胞遭到破壞使硫苷與黑芥子酶反應,降解成異硫氰酸酯,異硫氰酸酯具有較強的抗癌、抗氧化等生物活力。液相色譜-質譜聯用儀分析共鑒定得到5 種硫苷類物質,分別為丙烯基硫苷、1-磺酸-3-吲哚甲基硫苷、4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷、4-羥基-3-吲哚甲基硫苷和苯乙基硫苷(表1)。王志英等[27]測定甘藍苗中硫苷類物質時,也鑒定出以上幾種硫苷類物質。

表1 液相色譜-質譜聯用鑒定的水果甘藍硫苷成分Table1 Glucosinolate composition of fruit cabbage identi fi ed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry
表2為各硫代葡萄糖苷類物質在貯藏過程中的變化。鮮切水果甘藍中各硫苷類物質在貯藏過程中含量均呈下降趨勢。在貯藏8 d后,對照組、植酸浸泡處理組、臭氧處理組、臭氧聯合植酸處理組的丙烯基硫苷保留率分別為31.51%、35.53%、35.69%、36.17%,不同處理組樣品之間差異不大,1-磺酸-3-吲哚甲基硫苷的保留率分別為31.70%、35.16%、63.98%、64.84%,4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷保留率分別為55.98%、59.83%、65.38%、71.79%。由此可見,臭氧處理、臭氧聯合植酸處理均可明顯減少1-磺酸-3吲哚甲基硫苷和4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷在貯藏過程中的損失。4-羥基-3-吲哚甲基硫苷、苯乙基硫苷在水果甘藍中含量較低,各保鮮處理組與對照組差異不大。

表2 鮮切水果甘藍貯藏過程中硫苷成分及異硫氰酸鹽含量的變化Table2 Changes in glucosinolate and isothiocyanate contents in fresh cut fruit cabbage during storage
鮮切水果甘藍中硫苷的代謝產物,即異硫氰酸鹽的含量在貯藏過程中整體呈現先下降后上升的趨勢,且臭氧、植酸浸泡以及臭氧聯合植酸處理組樣品中異硫氰酸鹽含量顯著高于對照組。對照組樣品異硫氰酸鹽含量在貯藏前2 d快速下降,然后逐漸升高;其余處理組樣品也分別在貯藏第4天異硫氰酸鹽含量降至最低。在貯藏的8 d內,對照組樣品異硫氰酸鹽由462.03 μmol/100 g(0 d)降至204.92 μmol/100 g(8 d),在貯藏的第8天,臭氧、植酸浸泡、臭氧聯合植酸處理組的異硫氰酸鹽含量分別為542.95、324.78、562.11 μmol/100 g,其中臭氧聯合植酸處理組保留率最高。

圖4 不同處理鮮切水果甘藍貯藏過程中菌落總數的影響Fig.4 Effects of different treatments on aerobic plate count in fresh-cut fruit cabbage during storage
由圖4可知,鮮切水果甘藍在貯藏過程中菌落總數不斷增加,經過臭氧、植酸浸泡以及臭氧聯合植酸處理的樣品中菌落總數均顯著低于對照組樣品。貯藏8 d后,對照組鮮切水果甘藍中菌落總數由5.05(lg(CFU/g))上升至6.98(lg(CFU/g)),貯藏的第8天,植酸浸泡處理、臭氧處理、臭氧聯合植酸處理組的菌落總數分別為6.54、5.45、4.88(lg(CFU/g)),臭氧聯合植酸處理組菌落總數比對照組低2.10(lg(CFU/g))。有研究表明,當微生物數量超過7(lg(CFU/g))時,商業性鮮切蔬菜的貨架期在恒溫或控溫條件下不超過5~7 d[28],由此可知臭氧聯合植酸處理能有效延長鮮切水果甘藍的貨架期。臭氧抑制微生物生長主要是通過攻擊細菌的膜糖蛋白或糖脂實現的,植酸浸泡后的鮮切水果甘藍表面pH值較低,亦不利于微生物的生長[14]。兩種處理方式對微生物的生長均有協同抑制作用。
臭氧與植酸的聯合處理對于鮮切水果甘藍的保鮮效果較為理想。4 ℃貯藏8 d后,臭氧與植酸聯合處理組樣品中可溶性糖、可溶性蛋白含量高于其他組樣品,且分別比對照組樣品高0.21、0.28 倍,說明臭氧與植酸聯合處理有效了以上組分的保留率;同時臭氧與植酸聯合處理可提高鮮切水果甘藍中總酚含量,并提高了PAL、SOD活力,抑制了POD、CAT活力,延緩了水果甘藍的衰老;提高了水果甘藍中硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯的保留率,對于提升鮮切水果甘藍的品質和營養價值具有促進作用。另外,臭氧與植酸聯合處理顯著抑制了鮮切水果甘藍中微生物在貯藏過程中的生長,有利于延長產品的貨架期。
綜上所述,臭氧聯合植酸處理可有效降低鮮切水果甘藍在貯藏過程中的營養物質的損失,并降低微生物侵染的風險。