采前氯吡苯脲處理對采后‘秦美’獼猴桃細胞超微結構的影響

李圓圓，羅安偉*，蘇 苗，李 琳，白俊青，李 銳，藺志穎，宋俊奇

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃味道酸甜、氣味清新，并含有豐富的膳食纖維、VC、氨基酸、礦物質和抗氧化物質[1]，深受國內外消費者的喜愛。但在自然栽培條件下，獼猴桃果實較小、產量較低。據調查顯示，為提高果實單果質量及畝產量，陜西周至、眉縣及武功地區的獼猴桃在生長期間幾乎都使用氯吡苯脲（N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea，CPPU）處理。

CPPU是一種細胞分裂素類的植物生長調節劑，俗稱膨大劑，它能提高開花坐果率，促進果實細胞分裂，促使果實膨大[2]。但研究發現，高濃度的CPPU會引起較嚴重的果實風味變差、品質及貯藏性降低等負面效應[3-5]，微觀方面主要是細胞內部結構和細胞壁成分的變化，包括果肉細胞中葉綠體崩潰、線粒體降解、內質網和其他細胞器消失，同時細胞壁結構松散、降解。國內外關于不同處理對果實采后貯藏期間細胞超微結構影響的研究很少。Bu Jianwen等[6]通過透射電子顯微鏡觀察表明，紫外線-C照射延緩了番茄果皮細胞壁的分解。Loredo等[7]從細胞壁降解等微觀方面解釋了熱燙和/或滲透脫水對蘋果流變特性、質地和結構的關系。Alandes等[8]從超微結構方面說明了乳酸鈣處理能提高鮮切富士蘋果細胞壁穩定性。Hu Huigang等[9]從果肉細胞結構、細胞壁和膜的完整性方面說明蠟處理可降低低溫脅迫下黑心菠蘿的出現。Fava等[10]研究了H2O2浸泡、紫外線照射和超聲處理對葡萄細胞超微結構的影響，發現處理組果實外果皮中斷，中果皮塌陷及細胞出現質壁分離。任亞梅等[11]發現，1 μL/L 1-甲基環丙烯處理和1 μmol/L NO處理明顯延緩了獼猴桃果肉細胞壁的分解和葉綠體的解體。周慧娟等[12]研究發現黃肉桃果實采后貯藏過程中果皮細胞壁變形，有色體穩定性變差，線粒體減少。綜合國內外研究結果表明，果實在后熟衰老過程中細胞間隙大小、細胞壁結構、細胞膜及一系列細胞器結構都發生著復雜的變化[13-14]。而關于CPPU處理對獼猴桃采后貯藏期間果肉細胞超微結構影響方面的研究鮮有報道。本實驗以‘秦美’獼猴桃為試材，研究采前CPPU處理對采后獼猴桃果實冷藏期間細胞超微結構的影響，旨在為采后獼猴桃果實軟化衰老機制及其控制途徑的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試獼猴桃品種為‘秦美’，采自陜西省楊凌區一管理良好的獼猴桃基地果園，樹齡6 年。

CPPU 四川省蘭月科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇 廣東光華科技股份有限公司；體積分數25%戊二醛溶液 國藥集團化學試劑有限公司；四氧化鋨固定液 上海哈靈生物科技有限公司；醋酸雙氧鈾 上海寶曼生物科技有限公司；檸檬酸鉛 百靈威科技有限公司。所有試劑均為分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

HT7700型透射電子顯微鏡 日本日立公司；UC6超薄切片機 德國Leica儀器有限公司；SP-3000P光學顯微鏡日本株式會社拓普康；電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；TA.XT Plus/50物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

于獼猴桃盛花期后28 d用10、20 mg/L CPPU水溶液蘸果處理，蘸果時間3～5 s，以清水蘸果處理作為對照組。當果實可溶性固形物質量分數達到6.0%～6.5%時采收，采后及時運回冷庫。預冷24 h后用厚度0.03 mm的聚乙烯袋包裝，在0～1 ℃、相對濕度90%～95%下貯藏備用。在貯藏第0天（剛采收時）和貯藏90（貯藏中期）、150 d（貯藏末期）分別取樣，進行果實細胞超微結構觀察。

1.3.2 硬度測定

果肉硬度采用物性測定儀測定，每次測量15 個果實，最大量程25 kg，P5圓形探頭，探頭直徑為0.5 cm，單位為kg/cm2。

1.3.3 腐爛率測定

果實腐爛率根據式（1）計算。

1.3.4 質量損失率

果實質量損失率根據式（2）計算。

1.3.5 果實細胞超微結構的觀察

用雙面刀片將果肉（皮下3 mm左右）切成1 mm3大小的方塊，用體積分數4%戊二醛（0.1 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制），在室溫下固定16 h，同時抽氣直到切塊下沉為止。用0.1 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液進行沖洗（5、10、15、20、25、30 min各沖洗一次）。用體積分數1%鋨酸（0.2 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制）室溫下后固定2 h，之后磷酸鹽緩沖液再次沖洗，用體積分數30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液各脫水1 次，每次15 min，再用無水乙醇脫水2 次，每次30 min。Technovit 7100樹脂滲透后包埋，在60 ℃溫箱中聚合48 h，用超薄切片機切薄片，經醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行Duncan差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 2016軟件作圖；電子顯微鏡圖片用Photoshop軟件進行調色和清晰度處理。

2 結果與分析

2.1 CPPU處理對獼猴桃果實貯藏期間硬度的影響

圖1 CPPU處理對獼猴桃果實貯藏期間硬度的影響Fig.1 Effect of CPPU treatment on fruit fi rmness of kiwifruit during storage

果實在采后成熟衰老過程中，硬度呈現一直下降的趨勢。如圖1所示，使用CPPU處理的果實硬度均顯著低于對照組果實（P＜0.05），且與CPPU質量濃度呈劑量效應關系，質量濃度越大，果實硬度越低。從采收到貯藏第150天，對照組和10、20 mg/L處理組的硬度分別下降了76.21%、76.41%和76.63%。

2.2 CPPU處理對獼猴桃貯藏期間果實質量損失率和腐爛率的影響

由圖2A、B可知，獼猴桃果實在貯藏期間，隨著CPPU處理質量濃度的升高，果實質量損失率和腐爛率顯著增加（P＜0.05）。在貯藏第90、150天，20 mg/L處理組果實的質量損失率最高（圖2A）。出庫時，對照組的腐爛率最低，10 mg/L處理組次之，20 mg/L處理組最高，且各組之間差異顯著（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 CPPU處理對獼猴桃貯藏期質量損失率（A）和腐爛率（B）的影響Fig.2 Effect of CPPU treatment on mass loss rate (A) and decay incidence (B) of kiwifruit during storage

2.3 CPPU處理對貯藏期獼猴桃果實細胞超微結構的影響

2.3.1 CPPU處理對采收當天獼猴桃果實細胞超微結構的影響

圖3 CPPU處理對采收當天獼猴桃果實細胞超微結構的影響Fig.3 Effect of CPPU treatment on cell ultrastructure of kiwifruit on the day of harvest

由圖3A可觀察到獼猴桃果肉的細胞壁只有初生壁，沒有次生壁。相鄰細胞由兩層質膜分界的細胞壁隔開，并由胞間層所緊密連接。因此，相鄰兩細胞所共有的壁為3 層，即中間的胞間層與兩側的初生壁[15]。

剛采收的對照組與處理組的獼猴桃果肉細胞超微結構變化有一定的差異。剛采收時，細胞明顯液泡化，細胞質與內含物被擠成一薄層，緊貼細胞壁。對照組果實細胞壁整齊，厚度一致，結構完整，呈明顯的明-暗-明分區結構，胞間層為一薄的高電子密度的暗層，均勻而連續，內含物豐富，膜結構完整，未發生質壁分離（圖3A1）；線粒體是果實進行呼吸和能量代謝轉換的場所，與果實的衰老進程有密切的關系[16]，對照組果實線粒體結構清晰可辨，無破損現象（圖3A1～A3）；果肉細胞含有大量淀粉顆粒，粒大而明顯（圖3A2），相鄰細胞由胞間質緊密相連（圖3A3），此時獼猴桃果實硬度最高，硬度為14 kg/cm2。10 mg/L CPPU處理組的獼猴桃果實細胞壁、膜系統及線粒體等細胞器結構與對照組無明顯差異（圖3B1～B3），淀粉顆粒大而明顯，但數量明顯少于對照組（圖3B2），且細胞胞間質密度低于對照組（圖3B3）。20 mg/L處理的獼猴桃果實細胞壁仍整齊，結構完整，但暗層中膠層致密度明顯降低，細胞內含物豐富，膜結構仍完整，也未發生質壁分離（圖3C1）；線粒體結構清晰可辨，無破損現象，數量明顯少于對照組（圖3C1～C3）；淀粉顆粒數與10 mg/L處理組無明顯差異，但少于對照組（圖3C2）；細胞胞間質完全降解，出現小的間隙（圖3C3）。上述結果表明，不同質量濃度CPPU處理對剛采收的獼猴桃果實細胞超微結構的影響較小，但20 mg/L CPPU處理對獼猴桃果實線粒體、胞間質的影響大于10 mg/L CPPU處理。

2.3.2 CPPU處理對貯藏90 d獼猴桃果實細胞超微結構的影響

圖4 CPPU處理對貯藏90 d獼猴桃果實細胞超微結構的影響Fig.4 Effect of CPPU treatment on cell ultrastructure of kiwifruit after 90 days of storage

與剛采收的獼猴桃果實相比，采后貯藏90 d時的獼猴桃果實細胞壁開始松散，胞間中膠電子層仍明顯，但致密性降低，細胞質降解，淀粉顆粒減少，線粒體數量減少，結構受損，細胞間隙增大。但不同質量濃度CPPU處理對獼猴桃果實細胞超微結構的影響不同。其中對照組獼猴桃果實的細胞壁排列整齊，厚度均勻，但中膠層電子致密度下降（圖4A1）；線粒體、淀粉顆粒數量減少，線粒體個別降解，出現小泡（圖4A1～A3）；液泡膜個別出現破損，胞間質開始降解（圖4A3），失去淀粉的支撐和膨壓作用，果肉硬度迅速下降為5.13 kg/cm2，果實開始進入成熟狀態，腐爛率和質量損失率也明顯升高。10 mg/L CPPU處理組的獼猴桃果實細胞壁個別位點出現降解，導致壁厚度不均勻、彎曲變形，中膠層分解（圖4B1）；線粒體結構受損且數量明顯少于對照組（圖4B1～B3）；淀粉顆粒數減少，逐漸淡化（圖4B2）；液泡膜大量破裂，胞間質完全降解，細胞間出現小的間隙（圖4B3），果實硬度（3.66 kg/cm2）顯著小于同一時期對照組獼猴桃。20 mg/L CPPU處理組果實細胞壁多個位點出現降解，細胞壁嚴重變形，中膠層消失（圖4C1）；線粒體、淀粉顆粒與10 mg/L CPPU處理組無明顯差異（圖4C1～C3）；液泡膜破裂情況明顯比對照組嚴重，細胞間隙進一步增大（圖4C3），此時果實硬度（3.43 kg/cm2）與對照組貯藏150 d（貯藏末期）時的果實硬度無明顯差異，說明高質量濃度CPPU處理加速了獼猴桃果實衰老進程。上述結果表明，采前CPPU處理加速了采后貯藏90 d內獼猴桃果實細胞壁及內部結構的降解，且CPPU質量濃度越大，受損越嚴重。

2.3.3 CPPU處理對貯藏150 d獼猴桃果實細胞超微結構的影響

圖5 CPPU處理對貯藏150 d獼猴桃果實細胞超微結構的影響Fig.5 Effect of CPPU treatment on cell ultrastructure of kiwifruit after 150 days of storage

采后貯藏150 d的獼猴桃果實細胞壁結構降解部位不均勻導致嚴重變形，同時發生質壁分離，明暗分區不明顯，淀粉基本消失，線粒體降解，細胞間黏合能力喪失。但不同質量濃度CPPU處理對獼猴桃果實細胞超微結構的影響不同。其中對照組獼猴桃果實的細胞壁個別位點發生降解，導致細胞壁厚度不均勻，彎曲變形，質壁分離嚴重，中膠層降解（圖5A1）；線粒體變形、內容物解體，細胞器雙層膜模糊或消失（圖5A1、A2），淀粉顆粒大量分解（圖5A2）；連接相鄰細胞的胞間質消失，出現細胞間隙，細胞松散（圖5A3），此時硬度為3.33 kg/cm2，果實開始衰老、變軟，這與前人在桃[17-19]、蘋果[20-21]、柿子[22-23]、枇杷[24]及梅果[25]等中的研究結果相似。10 mg/L CPPU處理的獼猴桃果實細胞壁區域變得模糊（圖5B1）；線粒體只剩雙層膜結構，淀粉顆粒明顯少于對照組（圖5B1、B2）；細胞間隙擴大（圖5B3），腐爛率和質量損失率顯著高于對照組（P＜0.05）。20 mg/L CPPU處理的獼猴桃果實細胞壁降解程度高于10 mg/L處理組，細胞壁區域基本消失（圖5C1）；線粒體內含物與原生質互溶，嚴重空泡化，內部結構消失，淀粉顆粒完全降解消失（圖5C2），細胞間的黏合力喪失，相鄰細胞出現分離（圖5C3）。上述結果表明，經采前CPPU處理后，貯藏150 d的獼猴桃果實細胞壁嚴重降解，內部結構基本消失，且CPPU處理質量濃度越大，損傷程度越嚴重。

3 討 論

超微結構的變化是果實發育成熟及衰老過程的重要特征，反映了果實的生理狀態。隨著果實的后熟軟化，組織細胞的超微結構功能逐漸衰弱甚至喪失，果實的衰老與腐敗變質加速[26]。各處理組的獼猴桃果實在不同貯藏時期的細胞超微結構的變化表明，CPPU處理加速了獼猴桃果實細胞內部結構及細胞壁的降解，從而導致果實過早出現衰老、軟化。前人研究發現，經CPPU處理后的獼猴桃果實呼吸速率及乙烯釋放速率均增大[27]，細胞內產生大量的活性氧自由基[28]，從而使活性氧代謝失調，導致細胞膜脂過氧化作用加劇[29]，膜損傷程度增大、抗氧化能力降低[30-31]，主要細胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶活力升高（另行報道），且處理質量濃度越大，負面效應越大[32]，這些都與果實細胞內部結構破壞有關。細胞內部結構變化使細胞的區域作用減弱，水分、營養物質等內含物自由流出細胞，打破了果實固有的物質代謝程序，導致果實質地、風味的喪失。同時又為一些次生物的聚合或合成創造了底物、酶及其接觸的條件，加速了一系列衰老的生理反應[33]。

綜上所述，CPPU處理加快了果實在貯藏過程中細胞壁、線粒體及淀粉的降解速度，破壞了細胞器及膜系統的完整性，增加了果實的質量損失率及腐爛率，降低了果實品質及耐藏性；因此，獼猴桃生產中不建議使用CPPU處理。