細支卷煙中5種樹苔香味物質的氣相色譜-質譜法測定

黃延俊，蘇明亮，張建平，許寒春，劉澤春，王曉瑜，孫培健，聶 聰，謝 衛*，黃朝章*

(1.福建中煙工業有限責任公司技術中心,福建 廈門 361021;2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院,河南 鄭州 450001)

隨著消費者對健康的關注以及消費行為的改變，細支卷煙產品的研發與生產銷售成為我國煙草行業發展的趨勢[1]。相對于常規卷煙而言，細支卷煙通常指圓周小于24 mm的煙支，目前市面上的細支卷煙以圓周17 mm的煙支為主。歸因于圓周的減少，細支卷煙的橫截面積也隨之變小，比如17 mm卷煙的橫截面積僅為24 mm卷煙的一半，使得在正常抽吸條件下，通過細支卷煙的氣體流速高于常規卷煙。氣流狀態的改變導致卷煙燃燒狀況、成分輸送規律發生變化[2]，因此即使用相同的煙草配方，卷煙的抽吸感受也會發生明顯變化。因而，卷煙圓周的改變要求制造廠商對煙草配方和加工工藝也作出相應的調整。

樹苔屬于松蘿科扁枝衣屬的地衣植物，其提取物具有獨特的青滋香韻和濃郁的樹脂氣息，留香比較持久，是重要的天然香料[3-4]。樹苔凈油和浸膏是GB 2760-2014[5]規定允許使用的食品用天然香料，將其應用于卷煙加香后，可掩蓋煙草雜氣和泥土氣息，明顯增加煙氣濃度，且能改善口腔和喉部的舒適感，在煙用香精的調配中起著重要作用[6]。

樹苔香味物質的分析以氣相色譜-質譜聯用法為主[7-8]，對于不揮發的成分則可借助高效液相色譜[9]或高效液相色譜-質譜法[10-11]進行，然而對于煙草中樹苔香味物質的測試則未見報道。為了研究樹苔香味物質在不同圓周卷煙中的遷移規律，本研究采用氣相色譜-質譜對含有復雜基質[12-14]的煙絲和煙氣中的樹苔香味物質進行檢測。所建立的方法定性定量準確、抗基質干擾強、檢測靈敏度高、穩定性好，可用于評價香味成分向卷煙煙氣的遷移，從而為卷煙產品的設計提供有效的數據支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TRACE1310氣相色譜+ISQ LT四極桿質譜(美國Thermo公司)；RM200轉盤型吸煙機(德國Borgwaldt KC公司)；ML204電子天平(感量0.000 1 g，瑞士Metler Toledo公司)；Elmasonic S300超聲波萃取儀(德國Elma公司)；2-16P離心機(德國Sigma公司)；TurboVap II氮吹儀(瑞典Biotage公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

乙酸苯乙酯(標準品)、3，5-二羥基甲苯(苔黑酚，純度98%)、3-甲氧基-5-甲基苯酚(苔黑酚單甲醚，97%)、鹽酸(37%)、乙酸乙酯(色譜純)，購于百靈威公司；2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸甲酯(β-苔黑酚羧酸甲酯，>98%，美國Sigma Aldrich公司)；2，4-二羥基-6-甲基苯甲酸乙酯(苔黑酚羧酸乙酯，98%)、十六酸乙酯(97%)購于日本TCI公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、二氯甲烷、正己烷、甲苯、甲醇(分析純，國藥控股股份有限公司)；純水(自制，符合GB/T 6682-2008[15]中一級水的要求)。卷煙SFM(圓周17 mm)、XHM(圓周17 mm)、YFM(圓周24 mm)、對照卷煙(不添加香精，圓周24 mm)、煙用樹苔香精由福建中煙工業有限責任公司提供。

1.2 標準溶液的配制

分別準確移取一定體積的標準儲備溶液(苔黑酚單甲醚、苔黑酚、β-苔黑酚羧酸甲酯、十六酸乙酯、苔黑酚羧酸乙酯)和內標儲備溶液(乙酸苯乙酯)至50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，得其濃度范圍為0.02～1.00 μg/mL的系列標準溶液，內標濃度為0.22 μg/mL。

稱取約1.0 g對照卷煙煙絲，用20 mL乙酸乙酯萃取，萃取液用10 mL飽和食鹽水和0.5 mL 5%鹽酸洗滌，經無水硫酸鈉干燥后，用0.45 μm PTFE濾膜過濾，得到煙絲基質溶液。分別移取2.0 mL煙絲基質溶液至氮吹瓶中，在氮氣保護下吹掃至近干，再加入系列標準溶液，搖勻，靜置，得到煙絲基質匹配標準溶液。

使用轉盤型吸煙機按照GB/T 19609-2004的方法[16]抽吸20支對照卷煙，采用劍橋濾片捕集總粒相物。濾片用40 mL乙酸乙酯萃取，萃取液用10 mL飽和食鹽水和0.5 mL 5%鹽酸洗滌，經無水硫酸鈉干燥后，用0.45 μm PTFE濾膜過濾，得到煙氣基質溶液。分別移取2.0 mL煙氣基質溶液至氮吹瓶中，在氮氣保護下吹掃至近干，再加入系列標準溶液，搖勻，靜置，得到煙氣基質匹配標準溶液。

1.3 樣品前處理

稱取約1.0 g樣品卷煙煙絲，用20 mL含內標(乙酸苯乙酯0.22 μg/mL)的乙酸乙酯萃取，萃取液用10 mL飽和食鹽水和0.5 mL 5%鹽酸洗滌，經無水硫酸鈉干燥后，用0.45 μm PTFE濾膜過濾，得到待測煙絲溶液。

使用轉盤型吸煙機按照文獻[16]抽吸20支樣品卷煙，用φ92 mm劍橋濾片捕集總粒相物。濾片用40 mL含內標(乙酸苯乙酯0.22 μg/mL)的乙酸乙酯萃取，萃取液用10 mL飽和食鹽水和0.5 mL 5%鹽酸洗滌，經無水硫酸鈉干燥后，用0.45 μm PTFE濾膜過濾，得到待測煙氣溶液。

1.4 色譜-質譜條件

色譜柱：J&W DB-1701毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1.0 μL；分流比：10∶1；載氣：He，1.5 mL/min；程序升溫：起始溫度為60 ℃，保持2 min，以 4 ℃/min升至240 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；離子源：EI；電子能量：70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：250 ℃；溶劑延遲：8 min；質量掃描范圍：45～300 amu；采用SCAN和SIM同時掃描，NIST標準譜庫進行檢索定性。

圖1 5個目標物混合標準溶液(1.0 mg/L)的總離子流色譜圖

2 結果與討論

2.1 目標成分的確定及色譜-質譜條件的選擇

考察了某煙用樹苔香精，鑒定出苔黑酚、苔黑酚單甲醚、β-苔黑酚羧酸甲酯、苔黑酚羧酸乙酯和十六酸乙酯等主要成分，其中苔黑酚、β-苔黑酚羧酸甲酯和苔黑酚羧酸乙酯3個成分含量較高且均為樹苔的特征成分[4,17-18]；苔黑酚單甲醚含量較低，但其與β-苔黑酚羧酸甲酯的混合物可以模擬天然苔香氣息[6]；十六酸乙酯雖不是樹苔特征成分，然而其含量較高且結構與以上4種化合物有較大區別，可作為考察遷移的參考成分。因此，選擇以上5個成分作為目標物。如圖1所示，在“1.4”條件下5個目標物的色譜峰分離完全，峰形對稱且尖銳，表明適合于氣相色譜-質譜分析。5個目標化合物和內標的保留時間及特征離子如表1所示。

表1 5個目標物和內標的監測條件Table 1 Monitoring conditions for 5 flavoring compounds and the internal standard

圖2 不同溶劑對煙氣(A)和煙絲(B)中目標物的萃取效率

2.2 前處理條件的優化

2.2.1萃取方式的選擇蒸餾萃取法具有信息豐富、譜圖干凈、定性準確等優點[19]，但由于萃取時間較長、溫度較高且萃取環境開放，因而容易造成香味成分失真。相比而言，溶劑提取法的操作簡便快捷，重現性好，適合作為本研究中煙絲和煙氣分析的共同前處理方法。

2.2.2萃取溶劑的選擇由于所選目標物均為芳香環化合物或脂肪酸酯類化合物，因此考察了親油溶劑乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、甲苯以及親水溶劑甲醇的萃取效率。將混合標準溶液添加于對照卷煙煙絲和煙氣中，其萃取液經無水硫酸鈉干燥后直接進樣。以二氯甲烷為基準，使用不同溶劑萃取液中目標物與內標的峰面積比(ASol/ADCM)來比較溶劑的萃取效率(圖2)。結果顯示，正己烷的萃取效率最低，甲醇對小分子量的苔黑酚單甲醚和苔黑酚有較好的親和性，甲苯對較大分子量的β-苔黑酚羧酸甲酯、苔黑酚羧酸乙酯和十六酸乙酯有較好的親和性。乙酸乙酯則可以較好地萃取5個目標物，因此實驗選擇乙酸乙酯作為最佳萃取溶劑。

表2 5種目標物在煙絲和煙氣中的基質效應Table 2 Matrix effects of 5 analytes in cut tobacco and tobacco smoke

2.2.3萃取時間的選擇考察了萃取超聲時間分別為5、10、15、20、25、30 min時，煙絲和煙氣中5種目標物的萃取量。結果表明，隨著萃取時間的增加，煙絲中5種目標物20 min時達到萃取平衡，此后隨著萃取時間的延長，目標物的萃取量不再增加；而煙氣的5種目標物15 min即可達到萃取平衡，繼續增加萃取時間，目標物的萃取量幾乎無變化。因此，選擇煙絲和煙氣的最佳萃取時間分別為20 min和15 min。

2.3 基質的影響

基質效應是采用質譜進行煙草分析時必須考慮的問題。本文通過對比純品的標準溶液與添加基質的標準溶液的信號差異，來考察基質效應。對于每一種目標物，用0.1、0.2、0.5 μg/mL 3個水平下的基質溶液中的峰面積響應之和與相對應的3個水平下純溶劑配制的標準溶液中的峰面積響應之和的比值來考察基質效應[20]。由表2可知，煙絲和煙氣對目標物均存在基質增強效應，由于煙氣較煙絲更為復雜，因此增強效應尤其明顯，如β-苔黑酚羧酸甲酯和苔黑酚羧酸乙酯在煙氣中的信號分別約為純溶劑中的2.5倍和4.1倍，若不加以修正，將嚴重影響定量結果。為減小基質效應的影響，通常按照樣品前處理步驟提取不含目標化合物的“空白”樣品，并將提取液與標準品溶液混合，做成基質匹配標準工作溶液(Matrix matched calibration solution)對基質效應進行校正[21-22]。

2.4 方法驗證

2.4.1工作曲線、檢出限及定量下限按照“1.2”方法配制5個目標物的基質匹配標準溶液，以目標組分與內標的峰面積比(y)，對質量濃度(x,mg/L)繪制標準曲線，結果見表3。5個目標物在不同基質中均具有良好的線性關系，相關系數(r2)不低于0.996 8。采用優化方法，分別在煙絲和煙氣基質中對5個目標物進行加標實驗，分別按信噪比(S/N)為3和10計算檢出限和定量下限，煙絲基質中的檢出限和定量下限分別為0.79～3.0 ng/mL和2.6～10.0 ng/mL，煙氣基質中的檢出限和定量下限分別為0.60～2.9 ng/mL和2.0～9.6 ng/mL。以樹苔香精在煙絲中的正常添加量0.005%[6]、成分向煙氣中遷移10%計算，本方法能滿足對卷煙煙絲和煙氣中5個微量目標物的檢測要求。

2.4.2回收率與精密度選取空白煙絲和煙氣樣品，分別添加低、中、高(煙絲0.5、1.0、2.5 μg/cig和煙氣0.1、0.2、0.5 μg/cig) 3個水平的標準溶液，按照本方法進行加標回收率實驗，每一濃度樣品平行測定6次，結果見表4。在不同加標水平下，煙絲中5種目標物的平均回收率為90.5%～103%，相對標準偏差(RSD)為2.3%～12%；煙氣中5種目標物的平均回收率為85.6%～104%，RSDs為1.6%～9.3%。說明該方法的準確度及精密度較好。

表3 煙絲和煙氣中5種目標物的線性方程、檢出限及定量下限Table 3 Linear equations,detection limits(LODs) and quantitation limits(LOQs) of 5 analytes in cut tobacco and tobacco smoke

表4 煙絲和煙氣中5種目標物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 5 analytes in cut tobacco and tobacco smoke(n=6)

2.5 實際樣品的測定及遷移率的比較

以圓周17 mm的卷煙(SFM和XHM)以及24 mm的卷煙(YFM)為例，測試了其目標成分的含量，并比較了成分從煙絲到煙氣的遷移情況，結果如表5所示。3個卷煙中均未測出苔黑酚單甲醚，SFM中檢出少量的苔黑酚，但煙氣中未檢出，另外3個成分在不同卷煙中的含量不等；遷移率方面，3個卷煙不同成分的遷移率范圍為8.8%～45.5%,β-苔黑酚羧酸甲酯和苔黑酚羧酸乙酯的分子結構相近，因此遷移率接近，十六酸乙酯因沸點較低而具有較高的遷移率。

表5 不同卷煙煙絲和煙氣中目標物含量及遷移率的比較Table 5 Comparison of 5 analyte contents in cut tobacco and tobacco smoke of selected cigarettes and their corresponding migration ratios

* no detected

為滿足不同的消費需求，卷煙采用差異化的設計參數(表6)，如同樣是圓周17 mm的卷煙，SFM的濾嘴通風率和總通風率分別為51.1%和58.8%，XHM的濾嘴通風率和總通風率分別為22.5%和33.4%，較大的通風率使得卷煙煙氣被稀釋，減少了成分從煙絲向煙氣的遷移；比較了圓周17 mm和24 mm的卷煙，SFM和YFM的濾嘴通風差異顯著(51.1%和8.31%)，但二者成分的遷移率差異卻不及SFM和XHM(見表5)，這可能與卷煙圓周密切相關，因為細支卷煙的氣體流速大于粗支卷煙，通過調節濾嘴通風可以改變煙支的氣體流速，從而顯著改變成分的遷移率。

表6 3個規格卷煙的煙支物理指標Table 6 Physical parameters of SFM,XHM and YFM

3 結 論

本文建立了一種溶劑萃取結合氣相色譜-質譜測定卷煙煙絲和煙氣中5種目標物的分析方法，并用于評價細支卷煙中樹苔香味物質的遷移情況。5種目標物在所配制濃度范圍內線性良好(r2>0.996),檢出限為0.60～3.0 ng/mL，平均加標回收率為85.6%～104%，相對標準偏差為1.6%～12%。該方法操作簡便、靈敏度高、檢測結果準確，并有效克服了煙草基質的影響，所測試卷煙中成分的遷移率為8.8%～45.5%。相關數據為細支卷煙的設計提供了有力支持。