固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定貝類中3種短裸甲藻毒素

嚴忠雍，張小軍，陳 思，李佩佩，龍 舉，張 虹

(1.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018)

短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是一類聚醚類的脂溶性藻毒素，主要是由雙鞭甲藻及裸甲藻屬部分藻類產生的赤潮藻毒素[1-3]。短裸甲藻毒素是由10～11個環狀結構組成的大環多醚類物質，為較強的鈉通道激活毒素，可與鈉通道受體靶部位Ⅵ結合，開啟細胞膜上的鈉通道，使細胞膜對鈉離子的通透性增強，活化電壓門控鈉通道，進而產生較強的細胞去極化作用，引起神經肌肉興奮的傳導發生改變，因此亦被稱為神經性貝類毒素[4]。短裸甲藻毒素具有熱穩定性，其在貝類等生物體中的消除半衰期長達數十天甚至數月，加熱、微波等常規加工方式因降低了水產品的含水量而導致毒素濃度升高，會使食用者產生惡心、嘔吐、腹瀉、麻痹、昏迷等中毒癥狀[5-6]。因此，有必要加強水產品中短裸甲藻毒素的檢測工作，以利于海洋生態環境監測和水產品質量安全保障。

目前，短裸甲藻毒素的分析方法主要有小鼠生物法[7]、細胞毒性實驗[8]、放射免疫法[9]、酶聯免疫法[10-11]和液相色譜-串聯質譜法[12-15]。其中，小鼠生物法發展最早、應用最廣泛，但無法精確定量；酶聯免疫法檢測時間短，但易出現交叉反應；而高效液相色譜-串聯質譜法因分離能力強、靈敏度高而成為短裸甲藻毒素的首選分析方法。貝類除了含有脂肪、蛋白質、色素等雜質外，通常還含有分泌黏液，導致液液萃取過程中常出現乳化現象，同時也使一部分目標物被吸附，造成回收率低。因此，液相色譜-串聯質譜法測定貝類中短裸甲藻毒素主要以固相萃取法為前處理凈化手段，包括硅膠SPE柱[13]、聚合物SPE柱[15]等。硅膠SPE柱雖能有效凈化貝類樣品，但僅測定了BTX-C；聚合物SPE柱能同時測定3種短裸甲藻毒素，但前處理耗時長。本實驗以BTX類的基礎結構BTX-A和BTX-B，以及BTX類中毒性最強的BTX-C為研究對象，C18固相萃取柱為凈化手段，優化了樣品提取及萃取條件，縮短了前處理時間，并結合液相色譜-串聯質譜的高靈敏性和精確性，應用于貝類中BTX-A、BTX-B、BTX-C 3種短裸甲藻毒素的同時測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜Xevo TQ-S質譜儀(美國Waters公司);SPE-24固相萃取裝置(美國Supelco公司 )；MS3 Digital旋渦混合器(德國IKA公司)；Centrifuge5810高速離心機(德國Eppendorf公司)；超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)；Sep-Pak Vac C18固相萃取柱(6 mL/1 000 mg，美國Waters公司)。

BTX-A、BTX-B、BTX-C標準品(均為100 μg，臺灣Algalchem公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，美國Sigma公司)；乙腈、甲醇、丙酮(色譜純，德國Merck公司)；實驗用水為經Millipore系統處理的超純水。

BTX混合標準儲備液(10 mg/L)：用甲醇溶解BTX-A、BTX-B、BTX-C標準品，混合后定容至10 mL，于-20 ℃保存，有效期6個月。

BTX混合標準使用液(1 mg/L)：取1 mL BTX混合標準儲備液，用甲醇稀釋配成1 mg/L的混合溶液，于-20 ℃保存，有效期1個月。

1.2 樣品前處理方法

稱取1.00 g(準確至0.01 g)均質的待測樣品，置于15 mL離心管中，加入4 mL丙酮，渦旋振蕩2 min，常溫下超聲振蕩10 min，以5 000 r/min離心6 min，將上清液轉移至50 mL離心管后加入16 mL水，超聲振蕩0.5 min，待凈化。

移取上述混合液加至已用10 mL 20%(體積分數)丙酮水溶液活化的C18固相萃取柱。上樣結束后，用5 mL 20%(體積分數)甲醇水溶液淋洗，抽干柱內殘留液，并棄去全部流出液，再用3 mL乙腈洗脫，洗脫液收集于15 mL離心管中，旋渦振蕩1 min，過0.22 μm有機相微孔濾膜后，待分析。

1.3 色譜及質譜條件

色譜條件：ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；進樣體積為10 μL；樣品室溫度為4 ℃；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫：0～0.5 min，50% A；0.5～1.5 min，50%～35%A；1.5～9.0 min，35% A；9.0～10 min，35%～50%A；10～11 min，50%A。

表1 短裸甲藻毒素的質譜參數Table 1 Mass parameters of BTX

*quantitative ion

質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔氣流量：150 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；短裸甲藻毒素的母離子及子離子等質譜條件如表1所示。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

BTX-A、BTX-B、BTX-C屬親脂性化合物，其結構相似，常規的C18色譜柱即能滿足BTX液相色譜分析的需要。對3種BTX標準溶液進行色譜分離時發現，以含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液為水相，乙腈為有機相時，采用50 mm長的C18色譜柱在5 min內可有效分離3種分析物，且峰形尖銳對稱；但采用相同條件對樣品進行分析時，目標峰無法有效積分，信噪比低。因此改用長色譜柱，延長分析時間，并調試流動相的最佳梯度，最終確定最佳色譜分離條件如“1.3”所示。在此條件下，目標峰可在11 min內實現分離，且峰形尖銳，基線平穩(圖1)。

圖1 液相色譜優化條件下的貽貝樣品MRM圖

2.2 進樣試劑的優化

在液相色譜分析領域，通常采用初始流動相溶解分析物以去除溶劑效應，但3種BTX均為脂溶性毒素，分析時需溶于乙腈中，因此不能采用初始流動相。對比了3種BTX在不同體積分數乙腈中的響應值，結果顯示，在0～50%范圍內隨著乙腈體積分數的增大，3種BTX的響應值顯著增強；乙腈超過50%后響應值增加緩慢，乙腈比例為100%時達到最大值。因此，選擇純乙腈為定容試劑，未將固相萃取洗脫液(3 mL乙腈)濃縮，而選擇直接上機分析；不僅提高了目標物響應值，同時省去了濃縮步驟，縮短了前處理時間，提高了實驗效率。

2.3 質譜條件的確定

比較了正、負離子模式下3種BTX的響應信號，并對錐孔溫度、脫溶劑氣流量等質譜參數進行優化。結果表明：3種BTX在ESI+模式下的響應值較ESI-模式高，可產生穩定的 [M+H]+特征離子，將其確定為分析物的準分子離子峰，并優化毛細管電壓和錐孔電壓。通過對準分子離子峰的二級質譜裂解進行分析，根據碎片離子的豐度強弱，對定量定性離子和碰撞能量進行優化，最終確定的定量定性離子和碰撞能量見表1，3種BTX的二級離子質譜圖見圖2。

2.4 提取條件的優化

分別比較了丙酮、甲醇、乙腈3種提取劑對BTX的提取效率。結果表明，甲醇雖能沉淀蛋白質，但對3種BTX的提取效率較低；乙腈為極性非質子溶劑，對3種BTX的提取率較高，但乙腈毒性較大；而丙酮對3種BTX的提取率最高，因此對丙酮用量進行了進一步優化，最終選擇4 mL丙酮作為提取劑。

2.5 固相萃取條件的優化

BTX結構中大量存在的碳氫鍵能與C18官能團上的碳氫鍵產生非極性作用力，適合采用C18固相萃取柱富集凈化。提取劑丙酮的非極性作用力較大，易與固相萃取柱的官能團相結合，導致丙酮中的BTX不能有效富集，因此將4 mL丙酮與16 mL水混合作為上樣液，以增強上樣液的極性，提高目標物的富集效率。實驗選擇20%甲醇水作為淋洗液，能有效去除柱內的殘留雜質，且不影響目標物的化學狀態。根據洗脫液和目標物的極性，分別考察了采用乙腈、甲醇作為洗脫液時目標物的分離效果。結果表明：甲醇雖能有效洗脫BTX，但色譜基線干擾較大，信噪比低；而用3 mL乙腈即能有效洗脫目標物，且色譜基線較穩，信噪比和靈敏度較高，因此選擇3 mL乙腈為洗脫液。

圖2 3種BTX的二級離子質譜圖

2.6 方法的基質效應、線性關系及定量下限

基質效應(Matrix effect，ME)是指基質中除分析物以外的其他成分對分析物測定值的影響。實驗通過在處理過的空白基質中添加BTX標準溶液，以空白基質中BTX的響應值與純溶劑中BTX的響應值之比為ME值，計算得到本方法的ME值為94.6%～103.5%，表明不存在明顯的基質效應影響。

移取適量3種BTX混合標準使用液,配制質量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/L的系列標準工作溶液，以BTX的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。3種BTX均在1.0～100 μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數(r2)為0.996～0.997。以3倍信噪比確定本方法的檢出限(LOD)為1.0 μg/kg，以10倍信噪比確定本方法的定量下限(LOQ)為3.0 μg/kg。

2.7 方法回收率與相對標準偏差

準確稱取1.00 g陰性貽貝、縊蟶和青蛤樣品，添加5.0、20、50 μg/kg 3個濃度水平的3種BTX標準溶液，每個濃度水平重復6次，計算方法回收率和相對標準偏差(RSD)。結果表明，在3個加標水平下3種BTX的平均回收率為80.0%～87.5%；RSD為1.3%～5.4%(見表2)。

表2 3種短裸甲藻毒素的平均回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and RSDs for 3 BTX(n=6)

2.8 實際樣品分析

為確證方法的有效性和實用性，采用本方法對養殖和海捕的青蛤、泥蚶、貽貝、牡蠣、扇貝、縊蟶6 個品種共30 份貝類樣品進行檢測。結果顯示，被測樣品中均未檢出此3種BTX。

3 結 論

本文以丙酮為提取劑，建立了固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜定量分析貝類中3種BTX的方法。在最佳實驗條件下，方法檢出限為1.0 μg/kg，定量下限為3.0 μg/kg，平均回收率為80.0%～87.5%，RSD為1.3%～5.4%。該方法穩定可靠，靈敏度高，滿足目前對BTX的檢測需要，具有推廣應用價值，有利于海洋生態環境監測和污染源的調查追蹤。