超聲提取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定土壤中乙酰甲胺磷與甲胺磷的研究

魏立菲，李 逸，張 熒

(珠江流域水環境監測中心，廣東 廣州 510611)

甲胺磷(Methamidophos)是一種毒性強、污染大的高效有機磷殺蟲劑，我國自2008年1月起全面禁止甲胺磷的生產和使用。乙酰甲胺磷(Acephate)，學名O,S-二甲基-N-乙酰基-硫代磷酰胺，為甲胺磷的乙酰化產物，因具有高效、低毒、廉價等特點而作為甲胺磷的替代物之一在農業領域廣泛使用。乙酰甲胺磷由甲胺磷乙酰化制得，其制劑中有少量甲胺磷存在，同時，乙酰甲胺磷的制劑產品穩定性差，在降解過程中能代謝出甲胺磷[1]。我國農業部于2002年6月5日發布的第199號公告中規定禁止甲胺磷在蔬菜上使用，然而近年來甲胺磷農藥殘留超標事件時有發生，這與乙酰甲胺磷的使用密切相關。為保障農產品質量安全和農業環境健康，有必要對土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的殘留量進行監控。

目前，檢測乙酰甲胺磷和甲胺磷的常用方法有氣相色譜法(GC)[2-7]和氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[8-9]。乙酰甲胺磷和甲胺磷極性強、熱不穩定、易分解，易在GC進樣口被襯管和色譜柱前端吸附及降解，對儀器系統潔凈度要求較高，易出現進樣不出峰、峰信號弱、峰形差的情況，而土壤樣品基質復雜，易污染儀器，因此用GC或GC-MS分析土壤樣品中乙酰甲胺磷和甲胺磷的難度較大。文獻[10-12]使用高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)進行檢測，但靈敏度不夠，且紫外檢測無法準確定性[13-14]。

本文采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜(UPLC-MS/MS)檢測，對比了不同前處理方法，建立了土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的超聲提取/UPLC-MS/MS分析方法。該法簡便高效、靈敏度高、回收率好、定性準確，可滿足土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷殘留的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(美國Waters公司)；MassLynx V4.1工作站；S120H超聲波振蕩器(德國Elma公司)；Soxtec 2050全自動索氏抽提系統(丹麥FOSS公司)。50 mL螺口尖底帶蓋離心管(聚丙烯材質)；聚醚砜濾膜(直徑13 mm，孔徑0.22 μm，津騰公司)；化學分析濾紙(雙圈牌)。

標準物質：乙酰甲胺磷(GSB05-2322-2016)、甲胺磷(GSB05-2289-2016)的質量濃度均為100 mg/L(以丙酮為溶劑，農業部環境保護科研監測所)；甲醇、丙酮(色譜純，Merck公司)；乙酸銨、甲酸(優級純，Merck公司)；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司)。土壤樣品：采自增城遲菜心菜地。

1.2 前處理方法

1.2.1樣品采集與保存選取代表性的菜地，采集表層土壤，用鑷子剔除植物和葉等有機殘體，風干過20目篩，置于陰涼干燥處保存。

1.2.2超聲提取稱取10.0 g新鮮土壤樣品于50 mL帶蓋離心管中，加適量無水硫酸鈉混勻，加入20.0 mL甲醇，旋緊離心管蓋。超聲萃取30 min后靜置30 min，取上清液過0.22 μm濾膜于2 mL樣品瓶中，待分析。

1.2.3全自動索氏抽提稱取10.0 g新鮮土壤樣品于抽提紙筒中，加適量無水硫酸鈉混勻，以脫脂棉覆蓋樣品，量取80 mL甲醇(或丙酮)至抽提杯中。將裝有樣品的抽提紙筒、抽提杯放入抽提裝置。設定加熱板溫度160 ℃(丙酮用120 ℃)，浸沒沸騰30 min，回流淋洗60 min后，抽提杯中剩余約5 mL溶劑，將殘液全部轉移至20 mL比色管中，加甲醇定容至刻度，搖勻后取溶液過0.22 μm濾膜于2 mL樣品瓶中，待分析。

1.3 標準溶液的配制

準確移取100 mg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷溶液各0.1 mL于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，混勻，得1.00 mg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷混合中間溶液。再用甲醇將混合中間溶液稀釋成質量濃度分別為0.002、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、15.0、20.0 μg/L的乙酰甲胺磷、甲胺磷混合標準工作溶液。

1.4 色譜條件

Waters超高效液相色譜柱(ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；流動相：甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液(體積比65∶35)；等度洗脫；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；運行時間：2 min；進樣體積：1 μL。

1.5 質譜條件

采用多反應監測(MRM)模式檢測，外標法定量。離子化方式為電噴霧正離子化(ESI+)，毛細管電壓為1 kV，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為500 ℃，脫溶劑氣流量為650 L/h，錐孔氣流量為150 L/h，霧化氣壓力為700 kPa，碰撞氣流量為0.15 mL/min。乙酰甲胺磷和甲胺磷的其他質譜參數見表1。

表1 乙酰甲胺磷和甲胺磷的MRM分析參數Table 1 MRM analytical parameters of acephate and methamidophos

*quantitative ion

圖1 加標土壤(40.0 μg/kg)提取液中乙酰甲胺磷和甲胺磷的選擇離子流圖及TIC譜圖

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

比較了Waters超高效液相色譜柱HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)對目標物的分離效果，發現兩種色譜柱均無法分離甲胺磷和乙酰甲胺磷,但由于2種化合物有各自的MRM特征離子對，能提取出獨立的選擇離子流圖，因此保留時間重疊并不影響對2種化合物的定性和定量。在相同的流動相條件下，HSS T3色譜柱對極性大的乙酰甲胺磷和甲胺磷有更強的保留，且峰形更好。同時考察了甲醇-水、甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相等度洗脫的分離效果，結果顯示以甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液(65∶35)為流動相時的峰形和靈敏度最佳。綜上所述，本實驗選擇HSS T3色譜柱，以甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液(65∶35)為流動相等度洗脫，所得選擇離子流圖及TIC圖見圖1。

2.2 前處理方法的選擇

比較了超聲提取(提取液過濾紙)、超聲提取(提取液不過濾紙)、全自動索氏抽提(以甲醇為溶劑160 ℃下提取)和全自動索氏抽提(以丙酮為溶劑120 ℃下提取)4種提取條件對土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷回收率的影響(表2)。結果顯示，對于全自動索氏抽提法，由于乙酰甲胺磷和甲胺磷有一定揮發性，且均為熱不穩定化合物，在較高溫度下提取易損失，因此提取溫度越高，回收率越低。而超聲提取法在室溫下進行，避免了因加熱導致的損失，因此回收率明顯優于全自動索氏抽提法。由于濾紙會吸附少量的乙酰甲胺磷和甲胺磷，導致超聲后提取液用濾紙過濾的回收率偏低。還比較了不同超聲時間(10、20、30、60 min)對測試結果的影響，結果顯示回收率無明顯差異。實驗最終選擇土壤樣品經超聲提取30 min后靜置30 min，直接(不過濾紙)取上清液過濾膜進行檢測，該前處理方法簡單快捷，回收率也更滿意。

表2 不同提取條件下乙酰甲胺磷和甲胺磷的回收率Table 2 Recoveries of acephate and methamidophos under different extraction conditions

2.3 基質效應

在土壤等復雜樣品中，基質效應往往對分析物的檢測產生顯著干擾[12]。本實驗在多份空白土壤中加入甲醇，按照“1.2.2”方法處理土壤樣品后，用所得提取液配成質量濃度分別為0.2、2、20 μg/L的乙酰甲胺磷和甲胺磷混合溶液進行分析(響應峰面積A)，同時以甲醇配制上述3種質量濃度的對照液進行分析(響應峰面積A′)，以2種方法所得峰面積的比值(A/A′)表示基質效應。結果顯示，3種質量濃度樣品的峰面積非常接近，A/A′≈1，說明本方法基質效應影響小，無需凈化可直接進樣。

2.4 線性關系、檢出限與定量下限

按“1.3”配制標準系列工作溶液，按照本法進行測定，以乙酰甲胺磷或甲胺磷的峰面積(Y)對其質量濃度(X，μg/L)進行線性回歸。結果表明，乙酰甲胺磷和甲胺磷的線性范圍均為0.002～20.0 μg/L，線性方程分別為Y=44 991.5X+3 529.96和Y=118 393X+43.38，相關系數(r2)分別為0.999 9、0.999 5。

空白土壤中添加0.012 μg/kg的乙酰甲胺磷、甲胺磷標準溶液，按照本方法平行測定7份，計算標準偏差(S)。按照MDL=t(n-1,0.99)×S確定方法檢出限，當n=7、置信度為99%時，t=3.143；以4倍方法檢出限作為定量下限[15]。得到土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的檢出限分別為0.004 9、0.003 4 μg/kg，定量下限分別為0.020、0.014 μg/kg。

2.5 方法回收率與相對標準偏差

對空白土壤樣品進行0.400、4.00、40.00 μg/kg 3個濃度水平的加標實驗，按“1.2.2”方法對樣品進行處理，每個濃度平行測定6份，考察方法回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3。由表3可知，乙酰甲胺磷、甲胺磷在低、中、高3個濃度水平下的加標回收率分別為83.0%～91.5%和88.0%～94.8%，RSD分別為2.3%～4.8%和1.8%～4.2%。

表3 空白土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of acephate and methamidophos from blank soil samples at different spiked levels(n=6)

2.6 實際樣品測定

采用本方法測定了廣東省增城市小樓鎮遲菜心種植基地24個土壤樣品的乙酰甲胺磷和甲胺磷含量，結果均未檢出，表明該地區菜地土壤樣品未受目標物污染。

3 結 論

本文建立了超聲提取/UPLC-MS/MS檢測土壤中乙酰甲胺磷和甲胺磷的方法，樣品經超聲提取、過濾膜后(無需濃縮)直接上機測試，簡化了前處理流程，提高了測試效率，且避免了前處理過程繁瑣導致的回收率損失。方法簡便高效、回收率好、靈敏度高、定性準確，可用于大量實際土壤樣品中乙酰甲胺磷和甲胺磷含量的檢測。