Aerolysin蛋白納米孔道直接檢測單個DNA堿基修飾

路 瑤,胡正利,應佚倫,龍億濤

(華東理工大學 化學與分子工程學院 結構可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，上海 200237)

根據不同待測物分子穿過納米孔道時造成的離子流阻斷時間和程度不同，納米孔道單分子電化學技術可在單分子水平實時獲取待測物分子的結構、電荷、尺寸等信息[1-3]。生物納米孔道因其原子精度的穩定結構和超高空間限域分辨能力，近年來被廣泛應用于核酸、多肽、蛋白等生物分子的檢測研究[4-13]。Aerolysin 是一類來自嗜水氣單胞菌屬的β-成孔毒素，其水溶性單體在水溶液中能夠自發地聚合成七聚體的形態，形成形似蘑菇的跨膜蛋白孔道[14]。相比于其他種類應用更為廣泛的生物納米孔道，如a-Hemolysin(a-HL)和Mycobacterium smegmatis porin A(MspA)，Aerolysin 納米孔道具有更窄的孔徑(約1 nm)[15]。此獨特結構為單分子穿孔提供了更狹小的限域空間，提高了對單個堿基差異電流阻斷信號的分析能力[16]。Aerolysin 的另一個特點是其孔道內具有帶正電荷的氨基酸殘基，可增強核酸分子與孔道內壁的靜電相互作用，減慢核酸分子的穿孔速率，使得電流阻斷時間增長，有利于獲得單個核酸分子更為準確的細節信息[9,17-18]。這些獨有的優勢使得 Aerolysin 納米孔道在生物分子的分析中具有良好的應用前景。本課題組前期研究中利用野生型Aerolysin生物膜蛋白，在無需對納米孔道蛋白突變的情況下實現了單個核苷酸超靈敏分辨，且對單個單鏈DNA(ssDNA)單堿基長度差異的分辨率高達12%～17%[9]；該研究通過使用Aerolysin直接識別DNA寡聚體上的4種堿基，在此過程中無需固定DNA、組裝適配體、酶處理等操作，具有低成本、無標記、直接檢測、無酶作用的優勢[19]。在此基礎上，本文在ssDNA模板上設計引入線性側鏈基團，在Aerolysin納米孔道中實現了與其它兩種未修飾ssDNA之間單個堿基差異的非標記直接識別，進一步提高了Aerolysin納米孔道的單堿基測量能力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1,2-二植烷酰基磷脂(1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，美國Avanti Polar Lipids公司)；乙二胺四乙酸(≥99%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris,≥99%)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀(≥99%)、癸烷(≥99%)均購于美國Sigma-Aldrich有限公司；實驗用水為Milli-Q純水儀(Millipore)制備的超純水(電導率為18 MΩ·cm-1,25 ℃)；實驗所用DNA分析物Poly(dA)4-alkynyl、Poly(dA)5和Poly(dA)4均購于上海生工生物工程股份有限公司；Aerolysin表達、純化、組裝與文獻報道一致[20-21]。直徑1.0 mm的電極銀絲購于英國Alfa Aesar公司。

納米孔檢測微池購于美國Warner Instruments公司，由 cis 檢測池和 trans 檢測池構成。其中trans檢測池上支撐磷脂膜的微孔直徑為50 μm。納米孔道實驗檢測裝置包括：Axon Axopatch 200B電流放大器，AxonDigidata 1440A數模轉換器，Clampex 10.7數據記錄軟件，ClampFit 10.7數據處理軟件(美國Axon Instruments公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1溶液的配制使用水配制pH 8.0的電解質溶液，其中含有1 mol/L KCl、10 mmol/L Tris、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。使用水配制pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液，其中含有10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA。Proaerolysin溶于Tris-HCl緩沖溶液并配制成濃度為10 μg/mL蛋白溶液，納米通道實驗前加入胰蛋白酶活化[22]；1,2-二植烷酰基磷脂溶于癸烷并配制成濃度為2 mg/mL磷脂溶液；DNA溶于Tris-HCl緩沖溶液并配制成濃度為100 μmol/L的溶液。

1.2.2磷脂雙層膜的構建用磷脂刷蘸取少量磷脂溶液在納米孔trans檢測池50 μm微孔內外均勻涂抹磷脂溶液。通過提拉法形成磷脂雙分子層膜，并通過膜電容及擊穿電壓監測其厚度及機械強度。本實驗通過一對Ag/AgCl電極向磷脂雙分子層膜兩端施加驅動電壓并指定cis端為虛擬地，cis與trans檢測池中分別加入含1 mol/L KCl的10 mmol/L Tris-EDTA溶液(pH 8.0)。

1.2.3單個生物納米孔道實驗形成磷脂雙層膜后，在cis端檢測池中注入0.5 μL Aerolysin蛋白溶液。單個Aerolysin在磷脂雙分子層膜上自組裝形成一個穩定的納米通道時,離子流將產生量子化階躍即得到開孔電流信號。單個Aerolysin 納米孔道在22 ℃、1 mol/L Tris-KCl電解質溶液、100 mV 電壓條件下產生開孔電流約為48 pA。隨后,將待測生物分子加入檢測池中,在5 kHz濾波下以100 kHz采樣頻率進行信號記錄。本實驗3種分析物Poly(dA)4-alkynyl、Poly(dA)5和Poly(dA)4在cis端檢測池體中濃度均為2 μmol/L。實驗溫度控制在(22±2) ℃。

1.2.4數據處理數據處理時,將阻斷電流小于10 pA的事件視為噪音干擾,不做進一步分析。每一個阻斷電流大于10 pA的事件均通過MOSAIC軟件處理得到其阻斷電流及阻斷時間。進一步，利用Origin軟件(OriginPro 9.1)獲得單分子事件的阻斷時間統計直方圖及阻斷電流統計直方圖。

2 結果與討論

Poly(dA)5是由5個腺嘌呤核苷酸組成的寡聚核苷酸，在以往Aerolysin生物納米孔道單分子研究中發現其信號具有阻斷電流分布窄、電流分辨率高的特點[9]。本研究以寡聚核苷酸Poly(dA)5為模板，如圖1A所示，在其中間位點引入炔基衍生物線性側鏈從而設計單堿基位點變異的寡聚核苷酸Poly(dA)4-alkynyl，引入炔基衍生物線性側鏈后其相對分子質量相較Poly(dA)4增加251.1，相對分子質量增幅小于1個腺嘌呤核苷酸。進一步設計將結構差異1個腺嘌呤核苷酸的Poly(dA)4與Poly(dA)5、Poly(dA)4-alkynyl對照實驗，以研究單個堿基修飾對納米孔道特征阻斷電流的影響。

根據文獻報道[23]，ssDNA分子從 cis 端進入且穿過Aerolysin 納米孔道所造成的過孔信號具有電流阻斷呈現集中高斯分布、電流阻斷時間長(>0.13 ms)的特征；而ssDNA碰撞Aerolysin納米孔道cis端入口后最終返回cis 端溶液的單分子事件會產生尖刺狀的離子流信號，此類信號產生的電流阻斷時間短(<0.13 ms)且電流阻斷程度分布范圍較廣。本研究對阻斷時間大于0.13 ms的分子過孔信號進行分析，將單個阻斷電流信號的電流值定義為I,Aerolysin 納米孔道的開孔電流定義為I0,則單個ssDNA分子停留在Aerolysin孔道內造成的阻斷電流程度為I/I0(Residual Current%)，I/I0值越小代表阻斷程度越大；Duration代表分子穿孔造成電流阻斷所持續的時間。如圖1B所示，3種ssDNA分子在100 mV電壓下穿過納米孔道均產生特征的阻斷電流信號。其各自阻斷電流幅值恒定且與其他2種分子在阻斷程度和阻斷時間上有顯著差異。以阻斷時間為縱坐標,阻斷程度為橫坐標，統計繪制100 mV 電壓下阻斷電流的散點圖(如圖1C)。將阻斷程度數據進行統計分析，3種分析物在100 mV下阻斷程度直方圖均符合高斯分布，Poly(dA)5和Poly(dA)4的I/I0值分別為0.45和0.52。因此，在ssDNA結構上多1個腺嘌呤核苷酸使得納米孔阻斷電流程度I/I0值減小了0.07，即阻斷電流I增強了3 pA。而Poly(dA)4-alkynyl的阻斷程度I/I0值為0.38，其相較于Poly(dA)5的I/I0值減小了0.07，阻斷電流I增強了3 pA。因此，單個炔基側鏈基團的引入對阻斷電流程度的增強效果等同于增加1個腺嘌呤核苷酸。更重要的是，單個堿基修飾的Poly(dA)4-alkynyl分子的阻斷電流高斯峰半峰寬較Poly(dA)5減小了44%。因此，單堿基修飾結構有效提升了納米孔道對ssDNA分子的分辨能力(圖2A～C)。

圖1 ssDNA通過Aerolysin納米孔道實驗的原理圖

如圖2D～E所示，相較于Poly(dA)5和Poly(dA)4，Poly(dA)4-alkynyl分子中炔基側鏈的引入延長了單個核酸分子的阻斷時間，其阻斷時間擬合高斯峰中心為41.0 ms，與未修飾線性側鏈的Poly(dA)5(擬合高斯峰中心為6.2 ms)、Poly(dA)4(擬合高斯峰中心位于6.6 ms)相比，將單個ssDNA通過納米孔的速度減緩約80%，使短鏈ssDNA在Aerolysin納米孔道中的時間分辨提高近7倍。炔基側鏈的引入使得寡聚腺嘌呤核苷酸上具有1個堿基位點的結構變異，其單堿基水平上的結構和電荷改變可以通過Aerolysin納米孔道實現靈敏檢測。

圖3 Poly(dA)4-alkynyl在不同電壓下的阻斷電流程度直方圖

3 結 論

本文利用單個Aerolysin納米孔道在無需標記、無需擴增的條件下可直接分辨3種具有單個堿基差異的單鏈DNA。實驗結果顯示，具有單個炔基側鏈基團修飾的單個ssDNA在限域空間內與Aerolysin納米孔道的相互作用增強，電流阻斷程度增大，阻斷時間較未修飾ssDNA有效延長，且電流阻斷高斯峰半峰寬顯著減小。因此，單堿基側鏈的引入增強了Aerolysin納米孔道對單個核酸分子電流的分辨能力，有望推動Aerolysin納米孔在DNA直接測序及表觀修飾檢測中的應用。