結(jié)核分枝桿菌Rv1626的原核表達(dá)及其免疫功能研究

袁偉 許禮發(fā) 王曉春 張京燕 朱心怡

摘要：目的? 擬靶向結(jié)核分枝桿菌（M.tb）感染后的分泌期抗原Rv1626，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pPROEX-Rv1626并表達(dá)純化，通過人群和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫原性。方法? 構(gòu)建重組載體pPROEX-Rv1626，以全血干擾素釋放分析技術(shù)（WBIA）檢測(cè)其是否能被山西省長治市M.tb感染者的T細(xì)胞特異性識(shí)別;同時(shí)免疫小鼠，檢測(cè)其特異性誘導(dǎo)脾細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平及抗體水平。結(jié)果? ①成功構(gòu)建重組載體pPROEX-Rv1626，并成功誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定;②rRv1626蛋白誘導(dǎo)M.tb感染者外周血中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平均顯著高于健康者對(duì)照者（P<0.001），ATB患者外周血中淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平顯著高于LTBI人群（P<0.001）;③BCG+Rv1626/DMT組產(chǎn)生的特異性相關(guān)抗體滴度顯著高于Rv1626/DMT組及BCG組（P<0.01）;Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組的IgG2a/IgG1比值顯著高于DMT組和BCG組（F=33.69），且前兩組IgG2a /IgG1>1，傾向于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答;④不同免疫組小鼠無論是PPD或rRv1626蛋白刺激，BCG+Rv1626/DMT組均分泌最高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，其次為BCG組、Rv1626/DMT組，PBS組為最低。同時(shí)Rv1626/DMT組顯著高于DMT組（P<0.01）。結(jié)論? rRv1626能被M.tb感染者T細(xì)胞所識(shí)別，免疫小鼠能誘導(dǎo)抗原特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，可能與其提供的免疫保護(hù)力密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌;Rv1626;原核表達(dá);免疫原性;結(jié)核病

中圖分類號(hào)：R378.91+1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.022

文章編號(hào)：1006-1959（2019）01-0065-04

Prokaryotic Expression and Immune Function of Mycobacterium Tuberculosis Rv1626

YUAN Wei1，XU Li-fa1，WANG Xiao-chun1，ZHANG Jing-yan2，ZHU Xin-yi3

（1.School of Medicine，Anhui University of Science and Technology，Huainan 232001，Anhui，China;

2.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Heping Hospital，Changzhi Medical College，Changzhi 046000，Shanxi，China）

Abstract：Objective? To target the secretory antigen Rv1626 after Mycobacterium tuberculosis （M.tb） infection， construct its prokaryotic expression plasmid pPROEX-Rv1626 and express it for purification. The immunogenicity was evaluated by human and animal experiments. Methods? The recombinant vector pPROEX-Rv1626 was constructed and tested by whole blood interferon release assay （WBIA） to detect T cells specifically recognized by M.tb infected patients in Changzhi City， Shanxi Province. Simultaneous immunization of mice was used to detect their specific induction. The levels of IFN-γ， TNF-α and IL-2 secreted by spleen cells and antibody levels. Results? ①The recombinant vector pPROEX-Rv1626 was successfully constructed and successfully expressed， purified and identified. ②rRv1626 protein induced IFN-γ levels in peripheral blood of M.tb infected patients was significantly higher than healthy controls （P<0.0001）. At the same time， the level of IFN-γ secreted by lymphocytes in peripheral blood of ATB patients was significantly higher than that of LTBI （P<0.0005）;③The specific antibody titers produced by BCG+Rv1626/DMT group were significantly higher than those of Rv1626/DMT group and BCG group （P<0.01）.The ratio of IgG2a/IgG1 in Rv1626/DMT group and BCG+Rv1626/DMT group was significantly higher than that in DMT group and BCG group （F=33.69）， and the former two groups of IgG2a/IgG1>1 tended to Th1 type cellular immune response; ④Different The mice in the immunized group were stimulated with PPD or rRv1626 protein， and the highest levels of IL-2， IFN-γ and TNF-α were secreted in the BCG+Rv1626/DMT group， followed by the BCG group and the Rv1626/DMT group， and the PBS group was the lowest. At the same time， the Rv1626/DMT group was significantly higher than the DMT group （P<0.005）. Conclusion? rRv1626 can be recognized by T cells infected by M.tb. Immunized mice can induce antigen-specific Th1-type cellular immune responses， which may be closely related to the immune protection provided by them.

Key words：Mycobacterium tuberculosis;Rv1626;Prokaryotic expression;Immunogenicity;Tuberculosis

結(jié)核病（TB）由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引發(fā)，與獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、瘧疾（malaria）并稱為世界上三大主要的傳染性疾病。全球約有1/4人群感染M.tb，2016年全球TB新發(fā)病例約為1040萬，其中金磚五國占其總數(shù)的50%以上，中國的TB發(fā)病率和死亡率均在22個(gè)TB高負(fù)擔(dān)的國家位居前列[1]。盡管卡介苗（BCG）在全球接種覆蓋率超過90%，但對(duì)接種者的保護(hù)效應(yīng)僅能持續(xù)約5～10年，這可能是由于世界各地BCG培養(yǎng)和免疫策略不同，進(jìn)而導(dǎo)致基因型的改變[2]。由于BCG無法對(duì)成人TB提供足夠的免疫保護(hù)力，尤其對(duì)M.tb潛伏感染人群（LTBI）效果有限，故亟需更高效的結(jié)核病預(yù)防和治療性疫苗。本課題基于篩選和構(gòu)建M.tb感染分泌期高表達(dá)抗原Rv1626，以體外人群和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其免疫原性，旨在為新型結(jié)核疫苗的研究提供有效的候選靶抗原。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料? E.coli DH5α株、E.coli BL21（DE3）株購自Tiangen生物公司;SPF級(jí)C57BL/6小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;Ni-NTA 蛋白純化系統(tǒng)購自GE公司;人、鼠相關(guān)細(xì)胞因子ELISA kit檢測(cè)試劑盒均購自深圳Dakewe公司。二甲基三十六烷基銨（DDA）、單磷酰脂質(zhì)A（MPL）和海藻糖6，6'-二分枝菌酸（TDB）購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)? 分析pPROEX載體上的多克隆位點(diǎn)及Rv1626全序列酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物（P1： TTCGGATCC ACCGGCCCCACCACCGACG，P2： ATCTCGAG GGTGTCTTTGGGTGTTCCGAGGGTT）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃，5 min，94 ℃，50 s，65 ℃，50 s，72 ℃，40 s，30 cycles，72 ℃，10 min。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)、純化? 以分子克隆法將Rv1626基因片段導(dǎo)入原核表達(dá)載體pPROEX中，構(gòu)建重組載體pPRO-Rv1626，以BamHⅠ和XhoⅠ行雙酶切鑒定。過夜培養(yǎng)后，經(jīng)CaCl2和熱休克法轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，以終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再以Ni-NTA純化蛋白，4 ℃梯度透析36 h后以內(nèi)毒素清除試劑盒除去內(nèi)毒素（<0.1 EU/ml）。以15% SDS-PAGE及Western blotting分析鑒定蛋白，再以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3 IGRA檢測(cè)不同人群外周血抗原特異性IFN-γ水平? 委托山西長治醫(yī)院檢驗(yàn)科，病史采集、問卷調(diào)查及全身體檢，隨機(jī)選取感染者和健康者共40例，同時(shí)依據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)受試人群進(jìn)行初篩。感染者（包括ATB和LTBIs）：存在（或無）明顯TB感染癥狀、有與TB患者接觸史、痰涂片或痰培養(yǎng)陽性（或陰性）、胸部X光出現(xiàn)可疑陰影（或正常），以及結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）檢測(cè)陽性（TST≥5 mm）;健康對(duì)照者：無與TB感染者密切接觸史、TST檢測(cè)陰性（TST<5 mm）。

采集受試者的全血，以0.5 ml/孔加入無菌24孔板，并以5 μg/孔rRv1626蛋白進(jìn)行刺激，置37 ℃溫箱孵24 h。同時(shí)分別以等體積的PBS和PHA分別為陰性和陽性對(duì)照，收集血漿以人IFN-γ ELISA試劑盒檢測(cè)各孔IFN-γ濃度，并得出各孔最終值=實(shí)際測(cè)得值-PBS刺激的本底值。

1.2.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫方式? 6周齡雌性C57BL/6小鼠共30只，分為PBS組、BCG組、佐劑DMT（DDA、TDB、MPL）組、Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組，6只/組。具體免疫方式如下：①PBS組：200 μl PBS /只;②BCG組：200 μl /只（含菌1.2×106 CFU）BCG免疫1次;③DMT組：100 μl DMT混合100 μl PBS /只;④Rv1626/DMT組：含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只;⑤BCG+Rv1626/DMT組：先以200 μl/只（含菌1.2×106 CFU）BCG免疫1次，3周后以Rv1626/DMT（含40 μg rRv1626蛋白溶液100 μl混合100 μl DMT /只）增強(qiáng)免疫2次，間隔3周。注射方式：PBS組和BCG組分別為0周注射1次;DMT和Rv1626/DMT組免疫共3次，每3周注射1次;BCG+Rv1626/DMT組0周時(shí)先以BCG注射1次，3周后，以Rv1626/DMT增強(qiáng)2次，每3周1次。

1.2.5小鼠血清中抗原性特異性抗體水平檢測(cè)? 免疫9周后，對(duì)各組小鼠摘眶取血，收集各組小鼠血清，應(yīng)用間接ELISA法檢測(cè)抗原特異性IgG、IgG1、IgG2a滴度（以陽性結(jié)果最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示），以IgG2a和IgG1實(shí)際測(cè)得的稀釋倍數(shù)計(jì)算IgG2a：IgG1。

1.2.6 ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗原特異性IFN-γ、TNF-α和IL-2 水平? 無菌分離出小鼠脾細(xì)胞并定量，將100μl的2.5×106 /孔的脾細(xì)胞加入24孔板中，陽性對(duì)照組為PPD（10μg /孔）;陰性對(duì)照組為RPMI1640培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組為Rv1626蛋白（10μg /孔）。37 ℃培養(yǎng)24～72 h后，離心并收集上清，用鼠ELISA試劑盒檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子分泌水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 以SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，IGRA法檢測(cè)不同人群IFN-γ濃度水平，采用非參數(shù)U檢驗(yàn)，各組小鼠免疫原性相關(guān)指標(biāo)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 pPROEX-Rv1626原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)純化和免疫印跡分析? 經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為612 bp的序列片段，插入pPROEX后，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1626。經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切及測(cè)序鑒定無誤（見圖1A、B）。rRv1626蛋白誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)Ni-NTA柱以變性條件純化后，獲得分子量為22.4 kD蛋白產(chǎn)物，與預(yù)期符合（見圖1C、D）;經(jīng)Western blotting鑒定其成功表達(dá)。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度為1.6 mg/ml，蛋白總表達(dá)量為4.5 mg。在Bio-Rad凝膠成像儀經(jīng)圖像分析測(cè)得蛋白純度為92.2%。

2.2 rRv1626刺激受試者產(chǎn)生特異性IFN-γ水平比較? 委托山西長治醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科篩選出符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的受試者共40例，其中健康對(duì)照者、ATB患者和LTBI受試者及分別為10例、14例和16例。rRv1626蛋白誘導(dǎo)M.tb感染者外周血中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平均顯著高于健康者對(duì)照者（P<0.001），同時(shí)誘導(dǎo)ATB人群外周血中淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平顯著高于LTBI人群（P<0.001），見圖2A。非特異性刺激物PHA誘導(dǎo)受試者外周血中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.01），見圖2B。

2.3 Rv1626/DMT免疫小鼠誘導(dǎo)高水平的特異性IgG抗體? TMD組產(chǎn)生的IgG抗體及其亞類無顯著的特異性;BCG+Rv1626/DMT組產(chǎn)生的特異性相關(guān)抗體滴度顯著高于Rv1626/DMT組及BCG組（P<0.01）;Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組的IgG2a/IgG1比值顯著高于DMT組和BCG組（F=33.69），且前兩組IgG2a /IgG1>1，傾向于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，見圖3。

2.4 Rv1626/DMT免疫小鼠脾細(xì)胞分泌高水平特異性Th1型細(xì)胞因子? 不同免疫組小鼠無論是PPD或rRv1626蛋白刺激，BCG+Rv1626/DMT組均分泌最高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，其次為BCG組、Rv1626/DMT組，PBS組為最低。同時(shí)Rv1626/DMT組顯著高于DMT組（P<0.01）。PPD刺激時(shí)，BCG組水平顯著高于Rv1626/DMT組、rRv1626刺激時(shí)則反之（P<0.01）;各組表達(dá)的IL-4水平均較低且無顯著差異，見圖4。

3 討論

篩選M.tb感染后多個(gè)不同時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)抗原，并以之為候選靶抗原構(gòu)建TB亞單位疫苗，已成為當(dāng)今新型結(jié)核疫苗研究的重要策略之一。目前，絕大多數(shù)的新型結(jié)核亞單位疫苗仍聚焦于復(fù)制期優(yōu)勢(shì)表達(dá)抗原，如Ag85A、Ag85B和Rv3619等被廣泛用于TB疫苗研究中，且均證實(shí)具有較好的免疫保護(hù)效果[3]。近年來，已有12條疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，涉及表達(dá)單個(gè)或多個(gè)靶抗原的不同形式的疫苗有7種，其中亞單位疫苗有4種，尤其以單表達(dá)分泌期優(yōu)勢(shì)抗原為重要研究靶點(diǎn)。本課題的重要意義在于通過人群和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選出具有潛力的分泌期靶抗原。

Rv1626是M.tb感染復(fù)制期分泌的重要抗原[4]。Derrick SC等[5]在2013年使用結(jié)核分枝桿菌攻擊小鼠模型測(cè)試了16種抗原，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rv1626可顯著降低實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的肺、脾臟的荷菌量，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1型細(xì)胞免疫，刺激分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細(xì)胞因子。通過上調(diào)INF-γ激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力和加工提呈抗原能力，最終有效地殺死M.tb，以及升高IL-2水平以保護(hù)宿主抵抗M.tb的感染。可見Rv1626可能是潛在的免疫原性較強(qiáng)的靶抗原，可刺激機(jī)體分泌較高水平的抗原特異性Th1型細(xì)胞因子。

本研究首次構(gòu)建并成功克隆表達(dá)原核質(zhì)粒pPROEX-Rv1626，通過人群實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Rv1626誘導(dǎo)ATB者產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于LTBI者，同時(shí)刺激ATB和LTBI受試者產(chǎn)生的特異性IFN-γ水平顯著高于健康者，提示了Rv1626是可被M.tb 感染人群T細(xì)胞所識(shí)別的特異性抗原，是具有潛力的疫苗靶抗原。在免疫小鼠9周后以及以BCG初免、Rv1626增強(qiáng)免疫后，均誘導(dǎo)了較高水平的TNF-α、IL-2和IFN-γ，同時(shí)Rv1626/DMT組和BCG+Rv1626/DMT組小鼠血清IgG2a /IgG1>1，傾向于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。

綜上所述，本研究證實(shí)了Rv1626可被山西長治市M.tb感染人群T細(xì)胞特異性識(shí)別。在動(dòng)物免疫原性實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組抗原特異性Th1型細(xì)胞因子水平低于BCG組，可能與Rv1626僅為單個(gè)靶抗原、刺激水平不夠有關(guān);這也在BCG+Rv1626/DMT組誘導(dǎo)的相關(guān)細(xì)胞因子水平均顯著高于BCG組和Rv1626/DMT組得到了驗(yàn)證。rRv1626可被TB感染人群T細(xì)胞所識(shí)別、具有較好的免疫原性，為研制M.tb感染人群（尤其是LTBIs）的預(yù)防及治療型疫苗提供了候選靶抗原。本課題研究篩選并構(gòu)建了M.tb感染復(fù)制期優(yōu)勢(shì)表達(dá)抗原，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了深入分析，為構(gòu)建包含多階段抗原的融合疫苗、有效提高其抗M.tb感染的保護(hù)性研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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