Cocktail探針藥物法評價胃炎靈顆粒對大鼠體內CYP450活性的影響

馮星月，余 輝，蔣志濤，張詠梅*

0 引言

胃炎靈顆粒是張家港市中醫醫院的院內制劑，由白芍、枳實、梔子、香附、郁金等組成。具有疏肝理氣、清肝瀉熱、解痙止痛之功效，主治膽汁反流性胃炎。CYP450酶是藥物體內代謝的重要酶系[1]，其中6種重要的CYPs亞型-CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9參與了約90%的臨床使用藥物的代謝，CYP450酶被誘導或抑制是產生藥物相互作用的重要原因之一[2]。因此，推斷胃炎靈顆粒與其他藥物聯用時，可能會出現此現象。“Cocktail”探針藥物法是目前研究CYP450亞型酶活性的常用方法，能快速有效地評價藥物之間是否產生相互作用[3]。胃炎靈顆粒由中醫經驗方制成，且成分較為復雜，未見其對P450酶活性影響的報道。因此，本實驗采用混合探針法，參考相關文獻[4-11]，分別選用右美沙芬(CYP2D6)、咪達唑侖(CYP3A4)、奧美拉唑(CYP2C19)、茶堿(CYP1A2)、氯唑沙宗(CYP2E1)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)6種探針藥物，考察胃炎靈顆粒在大鼠體內對6種CYP450亞型酶活性的影響，預測其存在藥物相互作用的可能性，以提高臨床合并用藥的安全性，為胃炎靈顆粒的合理利用提供理論依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑 胃炎靈顆粒(張家港市中醫醫院制劑室，規格：10 g/袋，批號：20170206)；咪達唑侖注射液(江蘇恩華藥業股份有限公司，批號：20140602，規格：2 ml/10 mg)；注射用奧美拉唑鈉(江蘇奧賽康藥業有限公司，批號：15051811，規格：40 mg/支)；右美沙芬對照品(批號：097K11348)、咪達唑侖對照品(批號：171270-201402)、奧美拉唑對照品(批號：BCBF-2161V)、替硝唑對照品(批號：10036-200703)、茶堿批號對照品(T1633)、氯唑沙宗對照品(批號：017K1385)、甲苯磺丁脲對照品(批號：017K1025)、吡羅昔康對照品(批號：100177-200603)，其中咪達唑侖、替硝唑、吡羅昔康對照品為中國藥品生物制品檢定所提供，奧美拉唑、右美沙芬、茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲購自美國Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余均為分析純。

1.2 儀器 Waters Quattro Micro液質聯用儀(美國Waters公司)，Masslynx 4.1色譜工作站；MS105電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)；IKA Vortex Genius渦旋混合儀(德國IKA公司)；Labconco離心濃縮儀(美國Labconco公司)；SCQ-250超聲波清洗器(上海盛普機械制造有限公司)；Drict-Q5超純水機(美國Millipore公司)。

1.3 動物 健康雄性SPF級SD大鼠6只，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，體重(240±20) g，合格證編號：SCXK(蘇)2017-0001。動物飼養環境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，自然光照。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITYTM UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：4 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液-乙腈(25/75，V/V)；流速：200 μl/min；進樣量：5 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 質譜條件 采用電噴霧離子化方式(ESI)，毛細管電壓為3 500 V，離子源溫度120 ℃，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣體流速500 L/h。多反應離子監測模式(MRM)。正離子模式監測：替硝唑(內標)、右美沙芬、咪達唑侖、奧美拉唑；負離子模式監測：吡洛昔康(內標)、茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲。①替硝唑：m/z 248.1/121.1，錐孔電壓30 V，碰撞能力15 eV；②右美沙芬：m/z 272.1/171.1，錐孔電壓45 V，碰撞能力35 eV；③咪達唑侖：m/z 326.0/291.0，錐孔電壓35 V，碰撞能力28 eV；④奧美拉唑：m/z 346.0/198.0，錐孔電壓40 V，碰撞能力15 eV；⑤吡羅昔康：m/z 330.2/146.2，錐孔電壓25 V，碰撞能力為20 eV；⑥茶堿：m/z 179.0/164.1，錐孔電壓30 V，碰撞能力20 eV；⑦甲苯磺丁脲：m/z 168.0/132，錐孔電壓35 V，碰撞能力20 eV；⑧氯唑沙宗：m/z 168.0/132.0，錐孔電壓30 V，碰撞能力18 eV。

2.4 溶液的配制

2.4.1 Cocktail探針藥物溶液配制 分別稱取6種探針藥物適量，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉研磨混勻，用生理鹽水定容至50 ml棕色量瓶中，得含茶堿、苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、咪達唑侖、奧美拉唑鈉濃度分別為0.5、0.4、0.6、1.2、0.4、0.8 mg/ml的混合探針藥物溶液。此步驟所得溶液臨用前配制。

2.4.2 混合對照品、內標及質控溶液配制 精密稱取各探針藥物對照品適量，于同一10 ml量瓶中，加甲醇定容，配制成含茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、右美沙芬、奧美拉唑、咪達唑侖分別為564、720、408、10.24、10、10.76 μg/ml的混合儲備液。臨用時按倍比稀釋法配制成一系列濃度的甲醇混合對照品工作液。精密移取上述儲備液，臨用時依次配制成高、中、低3種不同質量濃度的甲醇質控溶液供分析用。

精密稱取內標替硝唑和吡羅昔康對照品適量，于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解，搖勻定容，得混合內標溶液。精密吸取上述溶液，加甲醇稀釋，得到替硝唑終濃度為1.6 μg/ml、吡羅昔康終濃度為24.2 μg/ml的混合內標工作液，于4 ℃冷藏備用。

2.4.3 大鼠灌胃藥物的制備 精密稱取胃炎靈顆粒12.5 g于50 ml量瓶，加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液適量，攪拌使其溶解，再定容至刻度，超聲處理10 min，即得。

2.5 動物給藥方法 6只大鼠適應性飼養1周，為了避免個體差異的干擾，采用自身對照法，進行前后兩輪對比實驗。第1輪，每天上午灌胃混合探針藥物10 ml/kg，給藥前12 h禁食不禁水，分別于給藥前和給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、2.5、3、5、8、12、24 h從眼底靜脈叢采血，4 000 r/min離心10 min后，吸取上清液于-20 ℃保存待用。第1輪結束后，進行第2輪實驗，每天上午灌胃胃炎靈顆粒(4 g/kg)，連續灌胃10 d，于第11天上午再次灌胃探針藥物，大鼠給藥劑量、取血時間點及全血處理方法均與第1輪相同。

2.6 血漿樣品處理方法 參考文獻[4]處理血漿樣品，取100 μl大鼠血漿樣品，加入10 μl混合內標工作液(替硝唑終濃度為1.6 μg/ml、吡羅昔康終濃度為24.2 μg/ml)，渦旋混勻30 s，加入800 μl

的乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，以12 000 r/min的轉速離心10 min，吸取上清液于2 ml離心管中，40 ℃水浴條件下氮氣吹干，殘渣用100 μl 50%的甲醇水復溶，渦旋混勻3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進樣5 μl檢測。

3 結果

3.1 色譜行為 此色譜條件下，6種探針藥物與內標分離良好，且血漿測定中無雜峰干擾，基線平穩(見圖1～圖3)。表明該測定方法特異性良好，能準確測定血漿中右美沙芬、咪達唑侖、奧美拉唑、茶堿、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的濃度，且重現性好。

圖1 空白血漿色譜圖

3.2 標準曲線 取空白血漿100 μl數份，加入“2.4.2”項下方法配制的一系列工作液10 μl，再加入混合內標10 μl，按“2.6”項下方法加入混合內標之后的方法處理。根據血漿標準曲線所測結果，以各探針藥物的質量濃度為X、各成分的峰面積與相應內標的峰面積比值為Y、1/x2為加權因子，進行線性回歸分析，得回歸方程。見表1。

表1 6種探針藥物的線性關系及定量限LOQ考察(μg/ml，n=6)

圖2 空白血漿+混合探針+混合內標色譜圖

圖3 1 h后的血漿樣本各探針藥物及內標的代表性色譜圖

3.3 精密度 按“3.2”項下方法制備含6種探針藥物的高、中、低濃度的含藥血漿，每個濃度平行5份，按“2.6”項下方法處理樣品，測定對照品峰面積As，及內標峰面積Ai，與標準曲線同日測定，日內重復測定5次，連續測定3 d，通過峰面積比值As/Ai，計算日內、日間精密度，結果見表2。

3.4 提取回收率與基質效應 按“3.3”項下方法制備高、中、低3個質控濃度的含藥血漿，每個濃度平行3份，按“2.6”項下方法處理樣品，測得各對照品及內標的峰面積為A。另取空白大鼠血漿100 μl數份，按照“2.6”項下方法操作，在乙酸乙酯萃取后吸取的上清液中加入對應濃度的混合對照品溶液和內標，同法操作，得峰面積B。另取上述與濃度相同的質控混合溶液和混合內標，按“2.6”項下“氮氣吹干”后方法操作，得峰面積C。A/B為提取回收率，B/C為基質效應。結果見表2，提取回收率及基質效應均符合要求。

表2 6種探針藥物在血漿中的準確度、日內日間精密度、回收率和基質效應(n=5)

3.5 穩定性 取“2.4.2”項下方法制備的中濃度質控溶液，按“2.1”項下的分析條件，對在室溫下0、1、2、4、8、24 h及在4 ℃保存2個月的樣品進行測定，記錄峰面積，計算各個探針藥物濃度的RSD；另取“3.3”項下制備的含中濃度混合探針藥物的血漿，按“2.5”項下的血漿樣品處理方法及“ 2.1”項下的分析條件，對在室溫下 0、1、2、4、8、24 h及在-20 ℃內冷凍保存7 d 內的樣品進行測定，記錄峰面積，計算各個混合探針藥物濃度的RSD。結果表明，6種探針藥物的穩定性良好。

3.6 藥動學參數

3.6.1 6種探針藥物的藥-時曲線圖 大鼠連續灌胃胃炎靈顆粒10 d前后灌胃混合探針藥物，按“2.5”項下血漿樣品處理方法及“2.1”項下的分析條件，得6種探針藥物的藥-時曲線圖，見圖4。

圖4 6種探針藥物給藥前后的藥-時曲線

3.6.2 6種探針藥物的藥動學參數 6只大鼠前后兩輪藥代動力學數據經DAS 1.0軟件處理，右美沙芬符合一室模型(W=1/C)，咪達唑侖符合二室模型(W=1)，奧美拉唑符合一室模型(W=1)，茶堿和甲苯磺丁脲符合一室模型(W=1/CC)，氯唑沙宗符合二室模型(W=1/CC)。6種探針藥物的主要藥動學參數見表3。

4 討論

通過參考文獻中6種CYP450亞型探針底物右美沙芬、咪達唑侖、奧美拉唑、茶堿、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的檢測方法[4-11]，本實驗建立了生物樣品中6種探針藥物含量的LC-MS-MS檢測方法；采用“Cocktail”法評價胃炎靈顆粒對大鼠體內CYP450酶6種亞型的影響。有報道，大鼠常被用來研究CYPs酶活性，預測有可能產生的抑制或誘導藥物相互作用[12]，這主要是因為大鼠體內參與代謝的主要酶亞型與人類相似[13]。本實驗采用整體動物自身對照的方法，均選用雄性SD大鼠，由于雄性大鼠體內CYP3A的活性與人體相似且較雌性大鼠高5～10倍[13]，此方法更有說服力，并且將動物個體間的遺傳代謝差異降低到最小[14]。筆者參考文獻[6]，確定6種探針藥物在體內不存在潛在代謝性相互作用，且實驗設計基本符合Cocktail法的條件。

由表4可知，甲苯磺丁脲CL/F降低31%，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次升高約1.33、1.43、1.38倍(弱抑制劑的1.25～2倍[15])，差異有統計學意義(P<0.01)。氯唑沙宗Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次降低約48%、23%、31%、31%(P<0.01)。奧美拉唑Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次升高約1.22、1.01、1.02倍(P<0.05)。右美沙芬CL/F、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞依次升高約2.7、3.78、2.22、2.18倍(中強抑制劑的2～5倍[15])(P<0.01)。茶堿Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均略有降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。咪達唑侖Cmax、AUC0-t、AUC0-∞略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

綜上所述，胃炎靈顆粒連續給予10 d后，右美沙芬、甲苯磺丁脲在大鼠體內的濃度升高，代謝減慢。結果表明，胃炎靈顆粒對CYP2D6有中強抑制作用，對CYP2C9有弱抑制作用。氯唑沙宗在大鼠體內的濃度降低，代謝加快，表明胃炎靈顆粒對CYP2E1有弱誘導作用。咪達唑侖、奧美拉唑和茶堿的代謝變化不明顯，表明胃炎靈顆粒對CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2基本沒有影響。由本試驗結果推測，胃炎靈顆粒可能對CYP2E1有誘導作用，對CYP2D6、CYP2C9有抑制作用，因此在臨床上胃炎靈顆粒與其他經CYP2D6、CYP2C9、CYP2E1代謝的藥物合用時，應考慮對其代謝的影響。為了避免由代謝性相互作用導致的藥物療效降低或毒副作用，提高臨床用藥的安全性和有效性，應充分考慮兩者合用的劑量。

表3 6種探針藥物的主要藥動學參數(n=6)

注：與給藥前比較，*P<0.05，**P<0.01