超濾-納濾聯(lián)合用于川貝母生物堿的濃縮工藝

駱靈敏，鄭敏霞

0 引言

川貝母(FritillariaeCirrhosaeBulbus)來(lái)源于百合科(Liliaceae)植物貝母屬(FritillariesL.)中多種植物的鱗莖，經(jīng)曬干或低溫干燥制得[1]。川貝母性苦、甘，微寒，歸肺、心經(jīng)，用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、咳痰帶血等[2]，是四川最具代表性的道地藥材之一[3]。川貝母中的主要活性組分為生物堿，包括西貝母堿、川貝堿和西貝素等等[4-6]。目前已見(jiàn)報(bào)道的川貝母生物堿類活性成分的提取方法主要有乙醇滲濾法[7]、氨水浸提法[8]、酸水浸提法[9]等，雖然提取過(guò)程有效提高了川貝母生物堿的提取效率，但是由于西貝母堿不耐光熱，在濃縮和干燥過(guò)程中，均出現(xiàn)了含量下降的問(wèn)題。膜分離技術(shù)在制藥行業(yè)中應(yīng)用日趨廣泛，其中納濾技術(shù)具有無(wú)熱效應(yīng)、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，超濾可以選擇性地去除大分子雜質(zhì)，有效保留小分子目標(biāo)成分。以上兩種膜組件串聯(lián)在中藥行業(yè)中的應(yīng)用尚處于摸索階段[12]。本文采用響應(yīng)面法，以西貝母堿為研究指標(biāo)，探討了超濾-納濾聯(lián)用優(yōu)化川貝母生物堿的納濾濃縮參數(shù)，建立了含有熱敏性小分子活性組分的中藥濃縮范例。

1 儀器與材料

TU-1901型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。聚醚砜納濾膜，截留相對(duì)分子量100、500、1 000，購(gòu)自杭州科百特過(guò)濾器材有限公司；聚偏氟乙烯超濾膜，截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000、50 000、100 000，購(gòu)自杭州科百特過(guò)濾器材有限公司。

川貝母飲片購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，并經(jīng)朱濤副主任中藥師進(jìn)行生藥學(xué)鑒定。西貝母堿對(duì)照品(批號(hào)：110767-201710)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(Tedia公司)，溴化鉀為光譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純(浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 川貝母提取液制備[13]取川貝母藥材20 g，加入14倍量(重量/體積)65%乙醇滲濾7 h，滲濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2 考察指標(biāo)的檢測(cè)

2.2.1 西貝母堿[1]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取西貝母堿對(duì)照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成每l ml含0.2 mg的對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 ml，分別加三氯甲烷至10.0 ml、水5 ml、0.05%溴甲酚綠緩沖液2 ml，振搖，放置分層。取三氯甲烷液，過(guò)濾，取續(xù)濾液在415 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=0.036 90 C-0.022 75，R2=0.994 7(n=5)，結(jié)果表明，西貝母堿質(zhì)量濃度在2.0～20.0 μg/ml范圍內(nèi)吸光度呈良好的線性關(guān)系。

樣品測(cè)定：取“2.1”項(xiàng)下提取液稀釋一定倍數(shù)，加濃氨試液3 ml，浸潤(rùn)1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液(以下簡(jiǎn)稱“混合溶液”)40 ml，80 ℃水浴回流2 h，濾過(guò)，濾液加混合溶液定容至50 ml，搖勻。精密量取2～5 ml，于水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 ml使溶解，照上述方法，測(cè)定吸光度計(jì)算，即得。

2.2.2 總蛋白[14]按BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法，使用相關(guān)試劑盒測(cè)定供試樣品中蛋白質(zhì)濃度。

2.3 超濾去除大分子 為達(dá)到提高納濾分離的效率、降低膜過(guò)濾系統(tǒng)的污染等目的，我們采用超濾法去除川貝母提取液中的蛋白質(zhì)等大分子。取“2.1”項(xiàng)下的川貝母提取液，分別依次通過(guò)截留相對(duì)分子量為100 000、50 000、10 000的超濾膜，以西貝母堿和總蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化情況為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)超濾過(guò)程的工藝參數(shù)進(jìn)行篩選。

2.4 納濾分離單因素考察 參照川貝母生物堿分子量等相關(guān)參數(shù)，我們選擇截留相對(duì)分子量為450的納濾膜進(jìn)行單因素考察及后續(xù)研究。取川貝母超濾液(1 L)置于納濾裝置中循環(huán)一定體積后，進(jìn)行納濾，待納濾過(guò)程完成后，即得納濾液。

為了考察膜吸附對(duì)于川貝母中西貝母堿等生物堿類成分是否會(huì)產(chǎn)生破壞，同時(shí)確定納濾工藝參數(shù)，以西貝母堿含量變化情況為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇藥液循環(huán)體積、溶液溫度、納濾壓力3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行單因素考察，具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 單因素考察參數(shù)

2.5 透過(guò)率和截留率計(jì)算 分別精密吸取納濾(或超濾)工藝中的平衡液、納濾液(或超濾液)，按“2.2”項(xiàng)下的測(cè)定方法，測(cè)定待測(cè)成分的濃度，透過(guò)率(T)、截留率(R)計(jì)算公式為：T=C1/C2×100%，R=(1-C1/C2)×100%，其中，C1為納濾液(或超濾液)中待測(cè)成分的質(zhì)量濃度，C2為平衡液中待測(cè)成分的質(zhì)量濃度。

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在納濾工藝參數(shù)單因素考察的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。我們選擇在納濾膜分離純化過(guò)程中，對(duì)結(jié)果影響最關(guān)鍵的3個(gè)因素：納濾膜截留相對(duì)分子量、西貝母堿濃度、溶液pH值作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的自變量，分別以-1、0、1代表自變量的變化水平，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2。

表2 納濾濃縮響應(yīng)面法考察因素水平表

3 結(jié)果

3.1 超濾大分子去除結(jié)果 不同截留相對(duì)分子量濾膜對(duì)川貝母提取液中生物堿類成分和蛋白質(zhì)類成分的分離情況見(jiàn)表3。

表3 不同截留相對(duì)分子量的超濾膜對(duì)生物堿類成分和蛋白質(zhì)類成分的分離情況

西貝母堿的相對(duì)分子量為429.6，在所有超濾分離試驗(yàn)中的透過(guò)率均達(dá)到98%以上，幾乎沒(méi)有損失。總蛋白的透過(guò)率結(jié)果說(shuō)明，超濾技術(shù)可有效去除川貝母提取液中的蛋白質(zhì)類成分，當(dāng)使用截留相對(duì)分子量為10 000的超濾膜時(shí)，幾乎可以將提取液中的蛋白質(zhì)類成分全部去除；但去除的效果隨著截留相對(duì)分子量的增大逐步下降。出于保留川貝母提取液中有效成分和去除大分子物質(zhì)兩者綜合考慮，我們選擇截留相對(duì)分子量為10 000的超濾膜，用于超濾分離過(guò)程。

3.2 納濾單因素考察結(jié)果

3.2.1 藥液循環(huán)體積考察 在進(jìn)行納濾濃縮時(shí)，部分西貝母堿會(huì)吸附在納濾膜表面，同時(shí)已經(jīng)吸附的成分會(huì)從納濾膜上解吸附下來(lái)，隨著藥液和納濾膜接觸的增加，吸附和解吸附速率逐漸相等，達(dá)到平衡。藥液循環(huán)體積因素考察結(jié)果見(jiàn)表4，可知納濾膜對(duì)西貝母堿的透過(guò)率產(chǎn)生了明顯的吸附作用，隨著循環(huán)體積的不斷增加，西貝母堿的透過(guò)率逐漸降低，當(dāng)循環(huán)體積為4 L時(shí)，透過(guò)率趨于穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)吸附速率和解吸附速率相同，達(dá)到平衡狀態(tài)。

表4 藥液循環(huán)體積對(duì)西貝母堿截留率的影響

3.2.2 溶液溫度考察 根據(jù)納濾膜供應(yīng)商提供的濾膜參數(shù)，結(jié)合川貝母中生物堿的穩(wěn)定性情況，納濾時(shí)的最高溶液溫度應(yīng)小于50 ℃，考察結(jié)果見(jiàn)表5。可知隨溶液溫度的上升，西貝母堿的截留率顯著下降，同時(shí)可觀察到膜通量相應(yīng)增加。其中，5 ℃時(shí)納濾膜對(duì)生物堿類成分的截留率最高，20 ℃時(shí)截留率略微下降，但與5 ℃結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)結(jié)果推測(cè)，隨著溶液溫度的上升，上述有效成分在納濾膜中的擴(kuò)散系數(shù)增大，擴(kuò)散加劇，從而更易通過(guò)納濾膜，使截留率下降。

表5 溶液溫度對(duì)西貝母堿截留率的影響

3.2.3 操作壓力考察 操作壓力直接影響納濾濃縮的效率，操作壓力越高，膜通量越大。操作壓力考察結(jié)果見(jiàn)表6。隨著操作壓力的升高，西貝母堿的截留率呈現(xiàn)出一定程度的升高，當(dāng)操作壓力為1.5 MPa時(shí)，截留率最高。

表6 操作溫度對(duì)西貝母堿截留率的影響

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化納濾工藝參數(shù) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，我們選擇的循環(huán)體積為8 L、溶液溫度為20 ℃、操作壓力為1.0 MPa，充分發(fā)揮納濾系統(tǒng)的濃縮能力，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確；每組試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，用截留率的平均值進(jìn)行后續(xù)分析，確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。

表7 納濾濃縮過(guò)程的響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

表8 納濾濃縮過(guò)程響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析

3.3.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn) 使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合分析，得到西貝母堿對(duì)上述3個(gè)自變量的二元回歸方程：西貝母堿截留率Y=92.52+6.73A+12.86B+6.79C+3.5AB-0.17AC+2.25BC-6.29A2-19.27B2-13.7C2。由該模型的方差分析可知，F(xiàn)值為43.49，P<0.000 1，說(shuō)明該模型顯著；3個(gè)自變量對(duì)西貝母堿的截留結(jié)果影響的順序?yàn)锽>C≈A，相關(guān)系數(shù)R2=0.982 4，預(yù)測(cè)R2=0.967 8，調(diào)整R2=0.979 8，說(shuō)明模型的擬合結(jié)果理想。綜上所述，該模型十分顯著，可有效進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案科學(xué)合理。

3.3.2 納濾過(guò)程條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 用“3.3.1”項(xiàng)下的回歸方程作圖，得到圖1。由圖1可知，3個(gè)自變量對(duì)于西貝母堿的截留情況均有不同程度的影響，其中對(duì)于截留情況影響最大的是超濾液濃度。隨著藥液濃度的升高，西貝母堿的截留率先提高，達(dá)到最高點(diǎn)后開(kāi)始下降，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面斜率變化最大，說(shuō)明在納濾濃縮過(guò)程中，西貝母堿濃度的影響占主導(dǎo)地位。pH值對(duì)截留情況具有一定程度的影響，當(dāng)超濾液pH值從堿性變?yōu)樗嵝裕飰A類活性成分逐漸離子化成為鹽，由于納濾膜荷負(fù)電，生物堿類成分的陽(yáng)離子鹽因?yàn)殪o電引力更難通過(guò)納濾膜的孔隙[15-16]，使截留率提高；但過(guò)低的pH值會(huì)影響濾膜的穩(wěn)定性，從而使截留率降低。納濾膜孔徑對(duì)于截留情況具有一定程度的影響，響應(yīng)曲面較為平緩。雖然納濾膜截留相對(duì)分子量跨度較大(100～1 000)，但是由于超濾液濃度及pH值的影響，使西貝母堿難于通過(guò)納濾膜，部分抵消了納濾膜孔徑變化對(duì)截留率的影響。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果的優(yōu)化分析，通過(guò)提高截留率來(lái)提高膜分離效果，得到的西貝母堿納濾工藝最優(yōu)工藝參數(shù)為：截留相對(duì)分子量為710、西貝母堿質(zhì)量濃度為243 μg/ml、超濾液pH為5.3；西貝母堿的截留率預(yù)測(cè)值為93.80%。考慮到實(shí)際操作的簡(jiǎn)便性和可行性，對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，選定的最佳參數(shù)為截留相對(duì)分子量為500、西貝母堿質(zhì)量濃度為140 μg/ml、超濾液pH為5.5。

以最優(yōu)工藝參數(shù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，西貝母堿實(shí)際截留率為93.57%(n=3)，相對(duì)偏差為0.25%，說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)測(cè)結(jié)果間偏差小，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信。

4 討論

加熱濃縮是中藥制劑濃縮最常用的技術(shù)手段，唐代即有關(guān)于煎煮濃縮的記載，具有簡(jiǎn)便易行、設(shè)備要求低、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)。但加熱濃縮過(guò)程因條件較為劇烈，常出現(xiàn)氧化、聚合及美拉德反應(yīng)，使部分熱敏性及穩(wěn)定性差的活性成分遭到破壞，一定程度上限制了加熱濃縮手段的應(yīng)用；此外，加熱濃縮能源消耗大，能源利用效率低，不符合國(guó)家綠色化學(xué)、綠色工業(yè)的倡議。超濾過(guò)程不產(chǎn)生熱量，濃縮效率高，能源利用效率高，很好地解決上述問(wèn)題，特別適用于以西貝母堿為代表的生物堿類活性成分(生物堿類成分通常穩(wěn)定性較差)的濃縮，為此類成分的濃縮提供了一種全新的技術(shù)路徑。

圖1 截留相對(duì)分子量、西貝母堿質(zhì)量濃度及pH對(duì)西貝母堿納濾結(jié)果的影響

隨著全新功能型新材料的開(kāi)發(fā)，濾膜在強(qiáng)度、化學(xué)成分定性及孔徑的可控性方面有了顯著的提升，膜分離技術(shù)也日益成熟，受到學(xué)界的關(guān)注。膜分離技術(shù)具備分離參數(shù)易控、重現(xiàn)性好、易于工業(yè)端的放大轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)。雖然以聚四氟乙烯濾膜為代表的新型濾膜的應(yīng)用已非常成熟，但由于其造價(jià)高、應(yīng)用與水相系統(tǒng)前需要用異丙醇浸潤(rùn)，在增加了分離成本的同時(shí)，也存在引入污染物的風(fēng)險(xiǎn)。因此,在進(jìn)行膜分離研究時(shí)，需要充分、全面地評(píng)估待分離組分，對(duì)體系內(nèi)各組分的化學(xué)特性進(jìn)行充分的評(píng)估，以選擇適宜材質(zhì)的濾膜。