復方夏枯草對自身免疫性甲狀腺炎大鼠Th1/Th2相關細胞因子的影響

金劍虹 劉國新 楊成 任興昌 洪郁芝*

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）屬于一種器官特異性疾病，其發病機制復雜，目前尚無統一的診斷標準，其以血清中大量甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）伴或不伴甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）升高為主要表現，病理學常可見甲狀腺組織中以淋巴細胞為主的細胞浸潤［1］。近年來其發病率逐年上升，全世界發病率已接近1‰［2］。常用治療方法有甲狀腺激素替代治療、糖皮質激素或免疫抑制劑治療。研究發現，AIT發病機制可能與T細胞主導的Th1/Th2免疫失衡密切相關［3］。本文探討復方夏枯草對EAT大鼠的療效及對Th1/Th2相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD雌性大鼠40只，4～5周齡，體重90～110g，購于上海BK公司，動物合格證：SCXK（滬）2013-0116。飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 藥物及試劑 豬甲狀腺球蛋（PTg）、完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）、碘化鈉（NaI），以上試劑均為美國Sigma公司產品。大鼠TPOAb、大鼠TgAb、大鼠IL-2、大鼠IL-10ELISA試劑盒，以上試劑均為美國ASSAY 公司產品。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。YJ-857型凈化工作臺、Bio-Tek ELX800全自動酶標儀、電子秤、37℃電熱恒溫箱、低溫冰箱（-20℃、-80℃）、微量移液器，及小試管、離心管、玻璃器皿、吸水紙等。

1.3 動物模型建立 大鼠購入后適應性喂養7d，按參考文獻［4-5］造模方法，對模型組大鼠飲用配制的0.064%高碘飲水（注意避光保存），食用普通飼料；每只大鼠予以0.2ml完全乳化制劑配制的（合PTg100μg）合劑，分別對其四肢內側、頸部背部、足蹠等多處進行皮下注射，1次/周，共2次，此為初次免疫。第3周開始使用不完全乳化制劑配制的合劑0.2ml，繼續按上述方法對大鼠進行多點皮下注射乳化抗原，1次/周，直至第8周結束，共8次，每次皮下注射注意更換至臨近位置，整個免疫過程密切觀察大鼠生命體征變化，及時做出調整。第8次加強免疫末，稱取大鼠體重，按照隨機數字表法，隨機抽取3只造模大鼠，麻醉后行腹主動脈取血，離心采取血清進行TPOAb、TgAb指標檢測。未干預大鼠（對照組）予以相同劑量的脂肪乳多點皮下注射，飲用蒸餾水及普通大鼠飼料。

1.4 實驗動物及分組 造模成功后將造模組27只大鼠按隨機數字表法均分為模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組三組，中藥各組大鼠使用配制好相對應濃度的中藥，按體重換算進行灌胃治療（中藥低劑量組予復方夏枯草4.675g/kg，中藥高劑組予復方夏枯草9.35g/kg），模型組及對照組均使用按體重換算的蒸餾水灌胃治療，注意大鼠的抓定及灌胃方法，同時密切注意大鼠一般情況變化，及時做出必要的調整。

1.5 觀察指標 大鼠中藥治療8周后，戊巴比妥麻醉后進行腹主動脈采血，靜置30min后3500r/min離心15min，獲取血清，采用酶聯免疫（ELISA）法檢測大鼠血清TPOAb、TgAb、IL-2、IL-10水平。各指標檢測方法大致相同，先后順序為標準品加樣、加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止、測定9個步驟，后在回歸方程中計算出待測血清指標濃度。

1.6 統計學方法 采用IBM SPSS Statistics 21.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗；非正態分布各組間比較采用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

干預過程中先后有4只大鼠因灌胃時食管破裂感染死亡，退出實驗，其余大鼠持續至實驗結束。

2.1 各階段大鼠TPOAb、TgAb比較 （1）造模結束時，利用隨機數字表法，從模型組30只大鼠中隨機選取10只大鼠，與對照組比較，顯示模型組兩抗體水平均明顯高于正常對照組（P＜0.01），提示本次實驗造模成功。見表1。（2）中藥干預4周時，中藥低劑量組與模型組比較，TPOAb、TgAb顯著降低（P＜0.01）；中藥高劑量組與模型組比較，TPOAb、TgAb降低（P＜0.05）。（3）中藥干預8周時，中藥低劑量組、中藥高劑量組與模型組比較，TPOAb、TgAb顯著降低（P＜0.01）。見表2、3。

表1 模型組與正常對照組TPOAb、TgAb比較（±s）

表1 模型組與正常對照組TPOAb、TgAb比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 大鼠數（只） 血清TPOAb（IU/ml） 血清TgAb（IU/ml）模型組 10 11.28±1.79* 31.49±2.68*對照組 10 4.27±1.52 16.21±2.26

表2 中藥干預4周時各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

表2 中藥干預4周時各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

注：與模型組比較*P＜0.01，#P＜0.05

組別 大鼠數（只） TPOAb（IU/ml） TgAb（IU/ml）模型組 8 11.91±2.51 29.56±2.49中藥低劑量組 8 8.90±1.33* 23.83±1.63*中藥高劑量組 8 9.79±1.33# 24.12±1.49#

表3 中藥干預8周時各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

表3 中藥干預8周時各組TPOAb、TgAb變化比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01

組別 大鼠數（只） TPOAb（IU/ml） TgAb（IU/ml）模型組 8 11.70±2.31 30.16±2.47中藥低劑量組 8 7.10±1.38* 22.16±2.42*中藥高劑量組 8 8.14±1.17* 21.58±2.03*

2.2 各階段大鼠IL-2、IL-10比較 干預4周和8周時IL-2治療組較模型組均有所緩解（P＜0.01）。而IL-10治療組較模型組均有所升高（P＜0.01）。

表4 中藥干預4周時各組IL-2、IL-10變化比較（±s）

表4 中藥干預4周時各組IL-2、IL-10變化比較（±s）

注：與對照組，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；▲P＜0.05

組別 大鼠數（只） IL-2（ng/L） IL-10（ng/L）模型組 8 269.50±26.70* 19.23±2.02*中藥低劑量組 8 209.60±22.20# 24.06±2.51▲中藥高劑量組 8 206.87±23.20# 22.97±3.43▲對照組 8 127.71±17.92 36.40±3.70

表5 中藥干預8周時IL-2、IL-10變化比較（±s）

表5 中藥干預8周時IL-2、IL-10變化比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別 大鼠數（只） IL-2（ng/L） IL-10（ng/L）模型組 8 275.94±16.89* 19.28±1.38*中藥低劑量組 8 181.19±20.89# 26.88±1.90#中藥高劑量組 8 193.15±14.27# 26.80±2.46#對照組 8 137.30±9.64 35.17±1.45

3 討論

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）是一種器官特異性疾病，發病率逐年增加，其發病機制復雜，目前尚無明確病因，推測其可能原因與基因、環境、生活飲食、工作壓力增加等相關。通過經典的造模方法［4-5］多次定量皮下注射豬甲狀腺球蛋白和持續高碘飲水作用于模型大鼠，檢測大鼠血清TPOAb、TgAb水平，造模大鼠出現雙抗體較對照組明顯升高，提示EAT模型建立成功。

多數學者［6-7］認為Th1/Th2失衡是AIT發病的主要原因，若能在Th細胞亞群選擇性分化前后進行干預，就有可能預防甚至終止AIT的發生和發展。已經證實存在多種細胞因子：IL-1α、IL-1b、IL-2、IL-4，IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、TNF-α和IFN-γ在炎癥細胞和甲狀腺濾泡細胞內，其中以表達IL-2和IFN-γ為主的Th1細胞可激發遲發型超敏反應，介導細胞免疫應答；以表達IL-4、IL-10、IL-13為主的Th2細胞可促進抗體產生，介導體液免疫應答。研究認為AIT患者的Th1/Th2細胞失衡往Th1方向偏離，本實驗檢測血清中白細胞介素IL-2、IL-10的變化，IL-2在造模結束時顯示其較正常對照組明顯升高（P＜0.01），在治療干預4周和8周時治療組較模型組均有所緩解（P＜0.01）。而IL-10有類似相反表現，在造模結束時顯示其較正常對照組明顯降低（P＜0.01），在治療干預4周和8周時治療組較模型組均有所升高（P＜0.01）。

在我國，中醫有多種方劑用于AIT治療［8］。其中夏枯草是比較重要的藥物之一，夏枯草性寒，味甘、辛、微苦，富含苯丙素和三環萜類、黃酮、酚酸、多糖等，具有抗炎、抗菌、免疫調節、抗腫瘤、抗細胞毒、降血糖、抗病毒以及抗腫瘤等作用，其中免疫調節、抗炎抑菌作用比較突出，療效較好［9-11］。黃芪主要成分是黃芪苷、黃芪多糖、氨基酸等，其中前兩者占主要成分，實驗研究發現黃芪苷具有抗感染、抗氧化、調節血糖、調節人體免疫力等作用。經研究發現其主要活性成分黃芪甲苷可以明顯降低患者血液中IFN-γ和IL-10的水平，通過增強機體激素作用和免疫抑制劑的抑制作用，降低細胞凋亡的水平，調節T 細胞亞群，使Th1/Th2 細胞比例失衡趨于正常［12-14］。另外本方劑中牛蒡子、黨參亦有一定程度的抗氧化、免疫調節的作用［15-17］。結合當前AIT發病機制的主流理論免疫失衡學說，以及各藥的現代研究、本實驗的治療效果，推斷夏枯草、黃芪、黨參可能是從免疫調節方面達到治療AIT目的，相關文獻［12，16，18］也支持該觀點。

綜上所述，TPOAb、TgAb造模后的升高，干預后的降低，提示該復方制劑確實可以緩解AIT大鼠的免疫損傷，有一定的治療效果。IL-2、IL-10的變化與文獻［3］中提示的Th1/Th2失衡相符合，進一步論證AIT的Th1/Th2免疫失衡學說，亦證實復方夏枯草可以改善AIT大鼠的免疫失衡，達到治療效果。而干預8周時較干預4周時各指標改善進度緩解，推測該復方制劑可能在早期干預療效較佳，在之后一段時間呈現一定程度的平臺期，繼續干預可能會出現進一步的改善，其原因考慮AIT本身為易忽視的慢性疾病，早期較長一段時間可能呈現血清學改變，而病理學改變滯后，且可能滯后較長時間。