利用MALDI-TOF MS特異質量峰對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性的快速分型

余佳佳,劉婧嫻,李媛睿,劉 瑛

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092)

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)是近年來受到廣泛關注的多重耐藥菌。2014年CHINET數據顯示，CRKP的檢出率達10%[1]，我院2017年耐藥監測數據顯示CRKP的檢出率已高達30%，呈現逐年增長的趨勢，對臨床抗感染治療帶來極大挑戰，對患者的生命安全帶來極大威脅。流行病學分析是監測感染暴發以及控制醫院感染的重要手段。近年來，隨著基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術的不斷發展，越來越多的研究[2-3]表明，MALDI-TOF MS在流行病學領域有較好的應用前景。利用MALDI-TOF MS進行流行病學分析，方法主要包括直接利用質譜儀器中配套的軟件進行主成分分析(principal component analysis, PCA)和核心圖譜(main spectra profile, MSP)聚類分析[4-7]，以及對質量圖譜進行特異質量峰篩選后再用于分型[8-9]。文獻報道，PCA聚類分析和MSP聚類分析可以鑒別區域流行[10-13]以及暴發感染的菌株[14-16]，但其分型效果與多位點序列分型(MLST)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)等分子分型結果符合度較差。對質量圖譜進行特異質量峰篩選后再進行聚類分析，可與分子分型結果達到較高的符合率[17-18]。而目前通過篩選特異質量峰進行分型的方法主要用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的分子流行病學研究，而針對CRKP的研究目前還較少。本研究旨在建立一種方法——利用MALDI-TOF MS質量圖譜中的特異質量峰對CRKP進行快速同源性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選取上海交通大學醫學院附屬新華醫院微生物實驗室前期收集并已進行MLST的69株CRKP，復旦大學附屬華山醫院惠贈的7株CRKP，共76株，其中52株用于特異質量峰分型方法的建立，24株用于特異質量峰分型方法的驗證。

1.1.2 試劑與儀器 甲酸和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司，HCCA基質和標準蛋白校準品(protein calibration standard Ⅰ)購自德國Bruker Daltonik公司，血平板、麥康凱平板購自上海伊華生物技術有限公司。電熱恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司，低速常溫離心機購自上海菲恰爾分析有限公司，MicroflexTM LT型質譜儀、96孔金屬靶板、Flex control 3.0軟件、MicroFlexTM Biotyper 3.0鑒定分析軟件、Clinpro Tools 3.0軟件以及Flex analysis 3.0圖譜分析軟件均購自德國Bruker Daltonik公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR儀和微量移液器購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 特異質量峰分型方法的建立

1.2.1.1 不同ST型別CRKP質量圖譜的獲取 選取52株CRKP，共包括25個序列型(Sequence Type, ST)，分別為ST11(6株)、ST520(6株)、ST48(6株)、ST37(5株)、ST423(3株)、ST323(3株)、ST14(2株)、ST65(2株)、ST846(2株)、ST2168(2株)、ST29、ST76、ST147、ST278、ST438、ST478、ST571、ST1696、ST1721、ST1722、ST1723、ST1725、ST2169、ST2170和ST2171各1株。從-80℃冰箱取出保存菌種進行復蘇，接種至麥康凱平板，35 ℃孵育過夜后取單個菌落轉種血平板，再次35 ℃孵育過夜，然后進行MALDI-TOF MS分析：每株菌取3個單菌落分別加入到70%乙醇中，13 000 r/min離心5 min，去掉上清后加入5 μL甲酸∶乙腈(1∶1)裂解液，裂解后取1 μL加入96孔金屬靶板中，自然干燥后，加1 μL基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix, HCCA)，干燥后進行檢測。校準品是標準蛋白校準品，參數設計m/z 2000-20000，shots:200，激光強度80%，每一個靶孔上在不同的位置獲取3個圖譜，則每株菌有9個質量圖譜，將圖譜進行軟件分析鑒定，當鑒定分數大于2.30時認為該菌株被準確鑒定至種水平，保存圖譜。將所有圖譜導入flexanalysis 3.0軟件，將質量圖譜中所有質量峰的基底拉至最低水平線，并對曲線進行光滑處理。

1.2.1.2 特異質量峰的篩選 本實驗共包含25種ST型別CRKP，將所有菌株圖譜進行分組，從而篩選出每種ST型別CRKP的特異質量峰，具體流程為：所有CRKP質量圖譜分成ST11型和非ST11型(包括除ST11型外的其他所有ST型)，兩組圖譜分別導入Clinpro Tools 3.0軟件，通過軟件統計學分析，獲得兩組間質量峰的比較分析結果。同樣的方法將所有菌株圖譜分成ST520型和非ST520型(包括除ST520型外的其他所有ST型)，再次將兩組圖譜分別導入Clinpro Tools 3.0軟件，通過軟件統計學分析，獲得兩組間質量峰的比較分析結果，以此類推獲得25個ST型的比較分析結果。然后根據分析的主要因素信噪比(signal/noise，S/N)，即細菌質量峰信號強度和機器自身產生噪聲的比值；變異系數(coefficient of variation, CV)，即質量峰強度在同一組細菌當中的離散程度；S/N比值，即不同分組間，質量峰信噪比的比值，通過以上3個主要因素制定特異質量峰篩選的標準。參照國外文獻中篩選特異質量峰的方法(S/N≥5，S/N比值≥2)[8]，設置5個不同的特異質量峰挑選標準，并按照不同的標準篩選各個ST型特異質量峰。標準1：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤50%；標準2：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤40%；標準3：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥2，(3)CV≤50%；標準4：(1)S/N≥5，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤50%；標準5：(1)S/N≥5，(2)S/N比值≥2，(3)CV≤40%。

1.2.1.3 最佳標準的確定 利用1.2.1.2中5個標準篩選得到的特異質量峰對52株CRKP中的29株菌(只選取包含3個或3個以上菌株的ST型別)進行分型，菌株ST型別包括ST11、ST37、ST48、ST520、ST323和ST423，將這29株菌的圖譜導入flexanalysis 3.0軟件，對所有S/N值>4的質量峰進行挑選，若無特異質量峰(S/N<4)，則賦值為0；若有特異質量峰(S/N>4)，則賦值為1；若特異質量峰S/N>10，則賦值為2。將獲得的數字信息導入SPSS軟件中，通過最遠鄰元素聚類分析方法進行聚類，并與MLST結果進行比較，將與MLST結果符合率最高的標準確定為最佳標準。

1.2.2 特異質量峰分型方法的驗證 另挑選24株包含5種常見ST型別的CRKP，分別為ST11(7株)、ST48(6株)、ST520(5株)、ST37(4株)以及ST423(2株)，對特異質量峰分型方法進行驗證。按照1.2.1.1的步驟獲取質量圖譜，按照最佳標準挑選出的特異質量峰對24株CRKP的圖譜進行分析并賦值，將獲得的數字信息導入SPSS軟件中，通過最遠鄰元素聚類分析方法進行聚類，并與MLST結果進行比較。

1.2.3 分型方法的比較 MALDI-TOF MS中的Clinpro Tools 3.0和MALDI Biotyper 3.0軟件可根據菌株質量圖譜對菌株進行聚類分析，包括PCA聚類分析和MSP聚類分析，本研究利用這兩種方法同時對上述用于驗證的24株CRKP進行分型，并將其結果與特異質量峰分型方法結果進行比較分析。

2 結果

2.1 特異質量峰分型方法的建立 按照標準2，共篩選出45個特異質量峰。按照特異質量峰，對29株CRKP質量圖譜的質量峰進行賦值并獲得數字列表。將數字導入SPSS軟件中，通過最遠鄰元素的聚類分析方法獲得分型結果，見圖1。圖中黑色粗豎線(距離約為12)將31株CRKP分成7組，其中5株菌分組不符，分別為ST37-KP174、ST37-KP55、ST520-KP164、ST48-KP236和ST48-KP227，其余24株CRKP分型結果與MLST一致，符合率為82.8%(24/29)。按照標準1、標準3、標準4和標準5挑選出的特異質量峰分型結果與MLST結果的符合率分別為72.4%、72.4%、72.4%和75.9%。綜合分析發現，按照標準2得到的質量峰分型效果最好，故確定標準2為最佳標準。

2.2 特異質量峰分型方法的驗證 將另外24株CRKP質量圖譜導入Flexanalysis 3.0軟件中，對基于標準2篩選出的45個質量峰進行分析并賦值后導入SPSS軟件，通過最遠鄰元素聚類分析方法獲得分型結果(圖2)。按照標準2的驗證結果在距離為12處(黑色粗豎線)將24株CRKP分成5組，與MLST結果(ST11、ST37、ST48、ST423和ST520)一致，其中有4株CRKP分類結果與MLST結果不符，ST11-KP361、ST520-KP221、ST520-KP214和ST48-KP246和ST37型菌株分在同一組。該方法與MLST結果的符合率達83.3%。

注：KP為新華醫院菌株編號，JS為華山醫院菌株編號

圖2 24株驗證菌株特異質量峰分型的聚類分析結果

2.3 分型方法的比較 利用MALDI-TOF MS中的Clinpro Tools 3.0和MALDI Biotyper 3.0對24株CRKP進行PCA聚類分析和MSP聚類分析。PCA聚類分析結果顯示，有8株細菌分組不符，其余16株CRKP分為5組，與MLST結果的符合率為66.7%。MSP聚類分析結果與MLST結果一致性較差，沒有明顯符合ST型的分組趨勢。見圖3、4。

圖3 Clinpro Tools 3.0軟件對24株CRKP進行PCA聚類分析的結果

圖4 MALDI Biotyper 3.0軟件對24株CRKP進行MSP聚類分析的結果

3 討論

目前，常用的分子流行病學方法主要有PFGE分型和MLST[19]。PFGE分型是通過限制性內切酶將基因組切割后進行脈沖場電泳分析，根據條帶的不同對菌株進行分型，該方法是分子流行病學分析的金標準[20]，但是操作較為繁瑣，需要特殊的儀器設備和專業的操作人員，不宜在實驗室常規開展；MLST是基于管家基因序列進行分型的方法，通過PCR擴增管家基因后對擴增產物進行測序，測序結果經比對后獲得菌株的ST型別[21]，該方法原理簡單，操作方便，但耗時較長，成本較高，難以對大樣本量的菌株進行快速分析。而利用MALDI-TOF MS進行流行病學分析的方法不需額外的費用和復雜的操作，快速、簡便，通過對質量圖譜進行分析便可獲取流行病學信息，為醫院感染防控和感染暴發監測提供依據。

利用MALDI-TOF MS技術獲得的質量圖譜中包含大量質量峰信息，可直接用于流行病學分析，但同時也存在不足，其中噪聲、重復性低、不穩定的質量峰，以及種屬特異的質量峰等都會對分型結果造成影響，因此，利用質量圖譜進行亞型區分時應先按照一定的標準進行特異質量峰的篩選，并根據篩選出的特異質量峰進行后續的分型。S/N是特異質量峰信號與噪聲的比值，比值越高表示特異質量峰的強度越高，說明特異質量峰對應的是某種菌株蛋白而非機器噪聲。CV是變異系數，是指該特異質量峰在同一ST型別多個菌株多個質量圖譜中出現的穩定性，CV值越小表明質量峰越穩定。S/N比值是某ST型菌株特異質量峰與其他ST型菌株的同一m/z特異質量峰的信噪比的比值，S/N比值越高，表明特異質量峰與ST型的相關性越好。本研究根據S/N、CV系數及S/N比值設置了特異質量峰的5個篩選標準，并確定最佳標準為：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤40%，按照此標準共挑選出45個特異質量峰，利用這些特異質量峰對24株CRKP進行分型，結果與MLST的符合率達83.3%，表明該方法具有較好的分型潛力。

特異質量峰分型方法是在菌株鑒定圖譜的基礎上，通過觀察特異質量峰，并根據特異質量峰強度進行的聚類分析。與PCA聚類分析和MSP聚類分析相比，該方法準確率高，排除了質量圖譜中CRKP種特異性質量峰的干擾，從而提高了對CRKP亞型區分的能力。與MLST等分子分型的方法相比，該方法不需要額外的成本，更加快速、簡便。在建立方法的基礎上，實驗人員只需獲得菌株的鑒定圖譜，即可通過分析獲得聚類結果，適合在臨床微生物室常規開展。本研究進行特異質量峰篩選時共選取了25個ST型的CRKP，并篩選出每個ST型的特異質量峰，當其中任何一種ST型發生暴發流行時，可通過篩選的特異質量峰將暴發流行的菌株進行聚類，從而快速獲悉其流行狀況。

利用MALDI-TOF MS菌株圖譜中特異質量峰進行細菌分型的方法也存在一定局限性，本研究包括CRKP的ST型別有限，但全球流行的ST型別多種多樣，特異質量峰的篩選只針對本實驗室中包含的ST型別，所以篩選出的特異質量峰只能對這些亞型進行有效區分，而無法判斷是否能區分其他亞型。由于本實驗中收集的存在流行趨勢CRKP的ST型較為局限，主要為ST11、ST520、ST37、ST48以及ST423，其他ST型CRKP菌株數量較少，無法用于特異質量峰分型的驗證，因此后續研究中需要繼續收集各ST型的CRKP，對該方法進行驗證。由于質量峰容易受菌株培養條件，孵育時間以及操作手法等影響，而本試驗室目前只是對特異質量峰分型的方法做了初步的探索，建立方法時設置的各項參數可能只適合于本試驗室，因此，其他實驗室利用MALDI-TOF MS質量峰進行深入分析時，應建立適合自己實驗室的標準，設置相應的參數，保證試驗的準確性和可重復性。

本研究初步顯示，MALDI-TOF MS在醫院感染流行病學分析領域具有較大的應用潛力。隨著數據庫的不斷完善，軟件的日益更新，MALDI-TOF MS有望在不久的將來應用于臨床微生物實驗室進行快速同源性分析，為暴發流行的監測和醫院感染的控制提供依據。