解毒通絡保腎法對高糖刺激下小鼠足細胞PI3K/Akt信號通路活化相關因子ILK、Akt及足細胞凋亡率的影響

成光宇 叢婷婷 呂美香 鄭菲菲 何澤

(長春中醫藥大學 1附屬醫院實驗中心，吉林 長春 130021；2 2014級中西醫結合內科碩士研究生；3 2016級中醫內科碩士研究生；4附屬醫院內分泌代謝病科)

糖尿病腎病(DN)是腎小球系膜細胞增殖、腎小球基底膜(GBM)增厚、細胞外基質增多和腎小球硬化等原因造成的〔1〕。足細胞為腎小球濾過屏障組成部分的重要結構。解毒通絡保腎散是治療DN的有效中藥處方，臨床取得良好療效〔2〕。本實驗主要探討解毒通絡保腎散對高糖誘導的小鼠足細胞的保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 永分化小鼠足細胞(MPC-5)，購自上海復祥生物科技有限公司，解毒通絡保腎散，由長春中醫藥大學附屬醫院中藥房提供，低糖DMEM培養基(HyClone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco公司)，無水葡萄糖(北京化工廠)，磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone)，整合素連接激酶(ILK)、蛋白激酶B(Akt)酶聯免疫試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，細胞凋亡試劑盒(貝博生物)。

1.2實驗儀器 二氧化碳(CO2)培養箱(北京誠茂興業科技發展有限公司)，超凈工作臺(上海博訊實業有限公司醫療)，酶標儀(美國BIORAD)，流式細胞儀(美國BIORAD)。

1.3實驗方法

1.3.1小鼠足細胞的復蘇、凍存與傳代 細胞常規復蘇用含10%胎牛血清和 DMEM低糖培養基在33℃、5% CO2培養箱中使其傳代增生，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3.2含藥血清的制備 解毒通絡保腎散由紅參10 g、生地黃15 g，枸杞子15 g，大黃12 g、黃芪15 g、金銀花15 g、地龍10 g、丹參15 g、黃連12 g、金蕎麥30 g組成。煎煮兩次濃縮直至含生藥1.125 g/ml。取Wistar大鼠16只,體重180～220 g，雄性，隨機分為空白組、解毒通絡保腎組。解毒通絡保腎組大鼠每日灌胃2次，每次3 ml，連續5 d，末次給藥1 h后腹主動脈取血，充分凝血后分離血清，56℃水浴滅活，-20℃冰箱保存備用。空白組大鼠灌服同等劑量的蒸餾水，與解毒通絡保腎組同時采血，分離血清備用。

1.3.3造模藥的配置 造模葡萄糖配置成最大濃度1 000 mmol/L，稱取1 g葡萄糖放入10 ml離心管，加入5 046 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝保存，用時稀釋至造模濃度180 mmol/L。

1.3.4實驗分組 正常糖組(A組)：加低糖DMEM培養基；高糖組(B組)：以高糖180 mmol/L刺激；C組：高糖+低劑量含藥物血清組(0.60%)；D組：高糖+中劑量含藥物血清組(1.25%)；E組：高糖+高劑量含藥物血清組(2.50%)

1.3.5樣本采集 ①處理細胞：細胞消化、傳代方法及細胞計數方法同1.3.1。②鋪板：將消化下來的細胞以1×105的濃度鋪至96孔板，每孔100 μl，留一列作為空白組，只加培養液100 μl。置培養箱中培養24 h。③加藥：設置空白孔、陰性對照孔、不同濃度含藥血清組。空白孔和陰性對照孔加入培養液100 μl，造模樣品孔加入含藥血清和含葡萄糖的培養基100 μl使含藥血清終濃度為0.000%、0.625%、1.250%、2.500%，每個濃度設6個復孔。④處理：置培養箱中培養24 h后吸出每孔的上清液，分裝在1.5 ml離心管中，做好標記，封口膜封好每個離心管，將上清液凍存在-20℃冰箱中，等待下一步實驗。

1.3.6酶聯免疫吸附試驗檢測ILK、Akt 樣本孔中先加入待測樣本10 μl，再加入樣本稀釋液40 μl；空白孔不加。除空白孔以外，標準品孔與樣本孔每孔各加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體 100 μl，并用封板膜封住反應孔，37℃水浴箱中溫育60 min。棄去液體，用吸水紙拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min 后，甩盡試劑盒孔內液體，并用吸水紙拍干，如此反復洗板5次。每孔加入顯色劑A與顯色劑B各50 μl，37℃避光15 min。顯色后除空白孔外其余均顯藍色；每孔加入終止液50 μl，此時藍色立即轉為黃色；15 min內，在 450 nm波長處測定各孔的光密度值(OD值)。

1.3.7流式細胞儀檢測足細胞凋亡率 將足細胞接種于12孔板，分成5組，加藥方法同上，24 h后每孔加入300 μl胰酶，消化1 min后加入600 μl培養基終止消化，反復吹打細胞收集至離心管中，每孔用預冷PBS沖洗1次，吹打后收集至上述離心管，500 r/min離心5 min后，棄上清液，用冷PBS洗細胞1次，吹打幾下后，1 500 r/min離心5 min后，棄上清液，用1×結合液重懸細胞，每管400 μl，在懸液中加入5 μl異硫氰酸熒光素(FITC)，2℃～8℃避光15 min，加入10 μl碘化丙啶(PI)，2℃～8℃避光5 min，用流式細胞儀檢測足細胞凋亡率。

1.3.8統計方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組ILK及Akt表達及足細胞凋亡率比較 與A組相比，B、C、D、E組ILK表達均顯著增加(P<0.05，P<0.01)，與B組相比，C、D、E組ILK表達均降低，但只有D、E組差異統計學意義(P<0.05,P<0.01)；與A組比較，B、C、D、E組Akt表達均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，與B組相比，C、D、E組Akt表達增加，但只有E組差異有統計學意義(P<0.01)。與A組相比，B、C、D、E組細胞凋亡率均顯著增加(均P<0.01)，與B組相比，C、D、E組細胞凋亡率顯著降低(均P<0.01)，與C組相比，D、E組凋亡率均顯著降低(均P<0.01)。見表1。

3 討 論

足細胞對維持腎小球濾過屏障的完整性起重要作用〔3〕。足細胞是避免機體蛋白質丟失的最后一道屏障，足細胞損傷或丟失可導致大量蛋白尿及腎小球硬化。足細胞是DM多種致病因素作用的靶點，同時也是DN重要的致病因素。

DN的主要病機是“毒損腎絡”，消渴病日久，氣血運行失常，產生氣滯、痰凝、血瘀等病理產物。這些病理產物日久則會化生為毒邪，毒邪入侵浮絡、孫絡等傷及腎臟及腎絡，導致腎臟功能與結構發生改變，從而發生DN〔4〕。ILK是一種存在于胞質內的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的連接細胞內外信號的蛋白激酶，研究發現，ILK激活直接導致足細胞的丟失〔5〕。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信號通路是影響細胞凋亡的重要途徑之一〔6〕，受體酪氨酸激酶與其配體結合發生磷酸化后激活PI3K，PI3K 活化后磷脂酰肌醇二磷酸(PIP)2生成磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PIP3和Akt N端的PH結構域結合，使Akt從細胞質轉移到細胞膜上進一步被磷酸化，并作用于下一蛋白，發揮作用。

前期實驗證明解毒通絡保腎散可以抑制實驗性DM大鼠腎臟肥大及高濾過，保護腎小球足細胞結構和功能〔7〕，本實驗通過高糖刺激小鼠腎足細胞發現足細胞凋亡率升高，說明確實發生了DN，符合了中醫毒損腎絡、腎之體用俱損機制。本研究說明在高糖的刺激下ILK-P13K-AKt信號通路已經活化，凋亡已經開始發生。解毒通絡保腎散能夠減少ILK并增加Akt的表達，初步證明解毒通絡保腎散對高糖刺激的足細胞的保護作用機制可能阻斷ILK介導的PI3K/Akt信號轉導通路，從而抑制足細胞凋亡，延緩DN的發生發展。