腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素的共表達及其免疫效力評價

彭國瑞，彭小兵，李旭妮，董令贏，蔣玉文

(中國獸醫藥品監察所，北京100081)

腐敗梭菌(Clostridium septium)可引起人和多種動物的惡性水腫、肌肉壞死、氣性壞疽和壞死性腸炎以及羊快疫等疾病，該菌可分泌α、β、γ和δ等多種外毒素，其中α毒素是主要的致病性毒力因子和免疫保護性抗原［1－3］。產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)也是一種重要的人畜共患病源菌［4］，根據產生外毒素 α、β、ε、ι種類的不同分為 A、B、C、D、E 5個型，其中D型常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的腸毒血癥，致死性強，ε毒素是該型主要致死性毒力因子和保護性抗原［5－6］。由這兩種病原菌引發的疾病往往發病急，病程短，來不及治療動物即發生死亡，故免疫接種是預防這兩種病最為有效的途徑之一。目前，國內用于預防羊快疫和腸毒血癥的疫苗有羊梭菌病多聯干粉滅活疫苗、羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯滅活疫苗和羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯四防滅活疫苗，近年來隨著養羊業的快速發展，該類疫苗的需求逐年增加，但疫苗的檢驗合格率和實際免疫效果卻并不十分理想［7］。諸多研究表明，通過基因工程大腸桿菌制備的有毒性或是無毒性的重組 α毒素［8－9］和 ε毒素［10－12］均具有很好的免疫原性。本實驗構建了可以共表達腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素的雙基因表達載體，探究了共表達產物的反應原性、毒性和相互作用等生物學特性，并將其制成基因工程滅活疫苗，評價了該疫苗的免疫效力，為羊快疫和腸毒血癥基因工程多聯疫苗的研制提供了試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 腐敗梭菌C55－1株、D型氣莢膜梭菌C60－3株、腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素及其抗毒素羊血清均由中國獸醫藥品監察所保存，自誘導培養基由中國獸醫藥品監察所配制。pETDuet－1 購自 EMD Biosciences，Inc;E.coli BL21(DE3)購自北京康為世紀生物有限公司。HRP標記兔抗羊IgG購自Sigma公司，酶標二抗顯色試劑盒購自Vector公司。PCR mix購自艾德萊生物公司、限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ、EcoRⅤ、XhoⅠ和 DNA分子量標準等購自寶生生物(大連)公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司。LB肉湯、TG培養基、TSB培養基等由北京中海生物科技有限公司提供，氫氧化鋁膠佐劑由中牧實業有限公司蘭州生物藥廠提供，其他試劑均為國產或進口分析純或試劑純。體重16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物公司，1.5～2.0 kg家兔購自北京隆安實驗動物中心。

1.2 共表達載體的構建

1.2.1 引物設計 根據GenBank腐敗梭菌α毒素和產氣莢膜梭菌ε毒素的基因序列設計2對引物(表1)，由中美泰和生物技術(北京)有限公司合成。

表1 擴增α毒素和ε毒素引物Tab 1 Primers amplifying C.septium α－toxin and C.perfringens ε－toxin genes

1.2.2 PCR 擴增 反應體系(25 μL):10×PCR 緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各 0.5 μL，模板 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 18 μL。分別以腐敗梭菌 C55－1株和D型產氣莢膜梭菌C60－3株基因組為模板PCR擴增。Gcsa反應條件:94℃10 min;94℃ 1 min，50℃1 min，72 ℃ 1.5 min，30 個循環;72 ℃延伸 10 min。Gcpe反應條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 2 min，30個循環;最后72℃延伸10 min。

1.2.3 pETDuet－Gcsa－Gcpe 的構建 EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切Gcsa PCR產物和pETDuet－1質粒，膠回收后，16℃連接過夜，轉化感受態E.coli BL21(DE3)，涂布Amp+LB平板，挑取單菌落，PCR和雙酶切鑒定。EcoRⅤ、XhoⅠ雙酶切經鑒定陽性的重組質粒pETDuet－Gcsa和Gcpe PCR產物，膠回收后連接，轉化感受態 E.coli BL21(DE3)，涂布 Amp+LB平板，挑取單菌落，進行PCR和雙酶切鑒定，同時送上海生工生物公司測序。

1.3 自誘導共表達及產物的鑒定

1.3.1 SDS－PAGE 分析 鑒定合格的 E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)接種 Amp+自誘導培養基，28℃ 220 r/min震蕩誘導表達24 h收獲，SDSPAGE電泳和灰度掃描分析表達量。

1.3.2 Western－blot鑒定 以腐敗梭菌抗毒素和產氣莢膜梭菌抗毒素血清分別作為一抗，HRP標記兔抗羊IgG作為二抗進行Western－blot檢測。

1.3.3 毒性和毒性中和試驗 自誘導收獲的E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)菌液經超聲波裂解，0.2 mL/只腹腔注射小鼠5只，鑒定表達產物的毒性。將腐敗梭菌抗毒素血清和D型產氣莢膜梭菌抗毒素血清分別與裂解菌液1∶1(V/V)混合，37℃孵育40 min，0.4 mL/只腹腔注射小鼠各5只;將兩種抗毒素一同與裂解菌液1∶1∶1混合，37℃孵育40 min，0.6 mL/只腹腔注射小鼠5只，進行毒性中和試驗。同時設E.coli BL21(DE3)裂解菌液、2種抗毒素血清和自誘導培養基對照，觀察7 d。

1.4 共表達產物的免疫效力評價

1.4.1 滅活疫苗的制備 自誘導收獲的 E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)菌液，加 0.4%甲醛溶液，密封，37℃滅活3 d，每天輕搖4～5次。滅活完全后加20%滅菌氫氧化鋁膠混勻，作為滅活菌苗備用。

1.4.2 無菌檢驗與安全檢驗 疫苗按照《中國獸藥典》2015版三部規定的方法進行無菌檢驗［13］。家兔4只各皮下注射疫苗5.0 mL，觀察10 d，進行安全檢驗。

1.4.3 免疫效力評價 疫苗1.0 mL/只頸背部皮下注射免疫家兔10只，對照組10只注射20%鋁膠PBS，21 d后以同樣的方法進行二免。按照《中國獸藥典》相關疫苗規定的方法，測定免疫血清中和效價并用毒素攻擊，分別采集一免21 d后和二免14 d后血清，將同組同次采集的血清等量混合制成混合血清，與經適當稀釋的腐敗梭菌和產氣莢膜梭菌毒素分別 1 ∶2 混合，37 ℃孵育40 min，0.3 mL/只尾靜脈注射小鼠各2只，觀察3 d，直到血清剛好能中和毒素。二免14 d后取免疫組家兔5只和對照組5只耳緣靜脈注射1 MLD腐敗梭菌毒素，另取免疫組5只和對照組5只注射1 MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素，觀察7 d。

2 結果

2.1 共表達載體的鑒定 提取待鑒定菌落的質粒經EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，用引物Fcsa和Rcsa PCR鑒定，見大小約1330 bp的片段與Gcsa預期大小接近;用 EcoR V、XhoⅠ雙酶切，引物 Fcpe和 Rcpe PCR鑒定，見大小約900 bp片段與Gcpe預期大小接近(圖1);測序結果顯示，Gcsa和Gcpe序列和閱讀框正確。以上結果表明，共表達載體pETDuet－Gcsa－Gcpe構建成功。

圖1 共表達載體的鑒定Fig 1 Identification of the co－expression vector

2.2 SDS－PAGE 和 Western－blot鑒定 自誘導E.coli BL21(pETDuet－Gcsa－Gcpe)表達產物經 SDSPAGE分析，以腐敗梭菌抗毒素血清和D型產氣莢膜梭菌抗毒素血清分別為一抗Western－blot檢測。結果顯示，在約49 ku處見特異條帶能夠與腐敗梭菌抗毒素血清反應條帶，表達量為0.28 mg/mL，在約33 ku處見可與產氣莢膜梭菌抗毒素血清反應的條帶，表達量為0.39 mg/mL(圖 2)。結果表明，Gcsa和Gcpe實現了共表達，且均具有反應原性。

圖2 共表達產物的SDS－PAGE和Western－blot鑒定Fig 2 Identification of the co－expression by SDS－PAGE and Western blot

2.3 毒性和毒性中和試驗 小鼠注射了沒有中和和用單一抗毒素血清中和的裂解菌液后，在觀察期內全部死亡;注射了用2種抗毒素中和的菌液以及E.coli BL21(DE3)菌液、抗毒素血清和自誘導培養基小鼠，均存活(表2)。結果表明，共表達產物同時具有2種毒素的毒性，進一步證實Gcsa和Gcpe獲得了共表達。

2.4 疫苗的無菌檢驗和安全檢驗 疫苗接種培養基均無菌生長，接種家兔后在觀察期內全部健活。結果表明，所制備的疫苗無菌檢驗和安全檢驗合格，可以用于免疫效力評價。

表2 共表達產物的的毒性及其中和試驗Tab 2 Result of toxicity and neutralization test of co－expression

2.5 免疫效力評價 疫苗免疫家兔，一免血清對腐敗梭菌毒素的中和效價為1 MLD/0.1 mL，對D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價為 5 MLD/0.1 mL;二免血清對腐敗梭菌毒素的中和效價為2 MLD/0.1 mL，對D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價≥50 MLD/0.1 mL。二免后用1 MLD腐敗梭菌毒素和D型產氣莢膜梭菌毒素分別攻擊，觀察期內免疫組均100%保護，對照組均全部死亡(表3)。結果表明，Gcsa和Gcpe的共表達產物具有免疫原性，其滅活菌苗免疫家兔可以同時抵抗腐敗梭菌和D型產氣莢膜梭菌毒素攻擊。

表3 免疫血清中和試驗和攻毒保護試驗結果Tab 3 Results of immune serum neutralization and immune protection tests

3 分析與討論

許多研究將共表達方法應用于目的蛋白與分子伴侶一同表達，其目的或是為了改變蛋白的表達形式，或是為了提高表達量，亦或是為了優化蛋白質空間構象和增強生物活性等。Zhang Y［14］等用共表達載體pETDuet－1將霍亂毒素B亞單位CTB與分子伴侶SKP一同表達，提高了CTB的可溶性表達比例和生物活性;Liu XL［15］等將影響莽草酸代謝通路的多種蛋白酶進行不同形式的組合共表達，比較了不同蛋白酶的不同組合以及順序的差異對莽草酸產量的影響;Lu XY［16］等嘗試了多種分子伴侶以不同方式組合共表達用于提高1，2，4丁三醇的產量。共表達方法在新型疫苗的應用研究方面，Yu YZ［17］等將破傷風毒素受體蛋白(THc)與硫氧還原(Trx)共表達，優化了蛋白構想，提高了THc的免疫原性。另外，也有將抗原基因與免疫刺激因子共表達增強了免疫效果［18］。

很多梭菌外毒素是主要的致病性毒力因子和免疫保護性抗原，研究表明，通過基因工程大腸桿菌可以獲得具有免疫活性的重組外毒素。而將共表達方法應用于羊梭菌多聯新型候選疫苗的研制，可以實現多種抗原同步生產。韓廣偉［18］等共表達了同一種梭菌D型產氣莢膜梭菌α毒素和ε毒素兩種外毒素，純化后免疫小鼠，證實二者能同時發揮很好的免疫原性。本實驗獲得了2種梭菌，分別是腐敗梭菌α毒素和D型產氣莢膜梭菌ε毒素的共表達，兩者同時保持其各自的生物活性，表達產物的免疫原性良好，一次免疫血清中和效價即可以達到《中國獸藥典》效力檢驗標準。在疫苗制備工藝方面，將含有重組抗原的工程菌菌液用甲醛滅活制成滅活疫苗，一方面甲醛在對工程菌滅活的同時，對毒素做了脫毒處理，保證了疫苗的安全;另一方面重組大腸桿菌本身在疫苗免疫過程中發揮了佐劑的作用，克服亞單位疫苗蛋白質分子量小免疫刺激弱的不足［19］;同時簡化了疫苗制備的工藝，省去了細菌裂解、蛋白質純化和包涵體復性等工序。此外，采用含乳糖的自誘導培養基誘導基因表達，代替了有毒性的IPTG，提高了疫苗的安全性。綜上，本試驗為梭菌病基因工程多價和多聯疫苗的開發提供了實驗基礎。