環孢菌素A菌渣無害化減量化技術研究

王欣榮 張雪霞 褚以文 鄭智慧 茍小軍 路新華 王勇軍

（1 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，四川抗菌素工業研究所，成都 610052；2 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，石家莊 050015)

菌渣是產生于微生物藥物提取過程中的工業廢棄物，主要含有已滅活的菌絲體、殘余培養基、微生物代謝產物、部分殘留效價，以及提取時加入的絮凝劑、助濾劑等成分。微生物素發酵產生的菌渣中抗菌素殘留較高，如頭孢菌素C在菌渣中的殘留約2～2.5mg/g，青霉素在菌渣中的殘留約1～2mg/g，紅霉素在菌渣中的殘留約0.2～0.9mg/g，環孢菌素在菌渣中的殘留約0.5～2mg/g，環孢菌素在菌渣中的殘留約0.1～0.4mg/g，這些殘留物最終都會進入環境中，日積月累可能會導致微生物逐漸產生耐藥性和其它未知的環境風險，2008年被列入《國家危險廢物目錄》[1]。現有菌渣無害化減量化處置技術如焚燒、填理以及制造肥料和飼料等普遍存在成本高、二次污染、殘留藥物積累等負面效應和隱患[2]。我國已經成為全球最大的抗生素原料藥生產國和出口國，原料藥產量已占全球總產量80%，其中出口占到全世界原料藥市場的70%以上。2012年全國抗生素產量約14萬噸，相應產生菌渣超過150萬噸，因此探討菌渣無害化、減量化處理顯得尤為重要[3]。

本研究以環孢菌素菌渣作為處理對象，研究采用多種嗜熱微生物進行無害化、減量化處理，實現環孢菌素生產過程中的菌渣減量排放和基本去除環孢菌素殘留。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱微生物1#：厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)、嗜熱微生物2#：土芽孢桿菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)和極端嗜熱菌3#：Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c，本研究組保藏。

1.1.2 培養基及培養條件

LB平板及斜面培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物8，氯化鈉8，瓊脂16，pH自然。

極端嗜熱菌YPG改性平板及斜面培養基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，磷酸氫二鉀2，自來水配制，pH7.2～7.4。

LB種子培養基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，自來水配制，pH6.8～7.0。

極端嗜熱菌種子培養基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，磷酸氫二鉀2，自來水配制，pH6.8～7.0。

LB發酵培養基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，自來水配制，pH6.8～7.0。

極端嗜熱菌發酵培養(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，磷酸氫二鉀2，自來水配制，pH6.8～7.0。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：試劑均為國產分析純，環孢菌素對照品購自美國藥典委員會。

儀器：立式蒸氣壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；Agilent technologies1200高效液相色譜儀；搖床(美國NBS)；發酵槽，200L微生物發酵罐系統(華北制藥工程裝備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養方法

培養溫度：厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)，培養溫度55℃，培養基為LB；嗜熱土芽孢桿菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)，培養溫度65～70℃，培養基為LB；極端嗜熱菌(Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c)，培養溫度75℃。

斜面及平板培養方法：無菌環取菌種涂布于培養基上，培養3～5d。

搖瓶種子培養：分別從各菌株斜面上刮菌苔接種于種子培養基中，培養1～2d，搖床轉速220r/min。待各菌液A600＞1.5，并瓶。并瓶后的種子液接種于發酵罐。

發酵罐培養：200L發酵罐內裝150L發酵培養基,接種量0.1%～0.5%(V/V)，發酵罐轉速100～200r/min，通氣量1:0.1～0.3，A600＞1.5終止培養。菌劑成品發酵液直接分裝10kg/桶。

1.2.2 菌渣的堆肥處理

試驗組：取環孢菌素菌渣，加自來水調成含水量50%～65%，加入0.1%菌劑(W/W)，用鏟車翻拌均勻，通氣量：0.1vvm。每隔3h測量1次堆心溫度，溫度超過對應嗜熱菌的上限翻拋一次物料。當一個處理階段后期溫度不再升高后，加入下一種菌劑(先加厭氧芽孢桿菌：菌劑A，然后是嗜熱地芽孢桿菌：菌劑B，最后加入極端嗜熱菌：菌劑C)。其中厭氧芽孢桿菌處理時溫度不能超過65℃，嗜熱地芽孢桿菌不超過80℃，而極端嗜熱菌不超過105℃。

空白對照組：取環孢菌素菌渣，加自來水調成含水量50%～65%，用鏟車翻拌均勻，通氣量：0.1vvm。每隔3h測量1次堆心溫度。

1.2.3 環孢菌素效價分析方法[4]

高效液相色譜系統為Agilent1200，色譜柱為C18反相柱(250mm×4.6mm, 5μm)；流動相為乙腈:水=80:20；柱溫70℃；檢測波長210nm；流速1.5mL/min；進樣量20μL。

1.2.4 碳氮磷鉀分析[5]

按照有機肥料標準NY525-2012測定全碳、全磷、全鉀和全氮的含量。

2 結果

2.1 堆肥處理過程中的各項指標變化情況

堆肥過程中的溫度變化是堆體內微生物活性變化的重要反應。堆體中的水分不僅可以作為微生物代謝和生理活動所需營養物質的載體，還可以蒸發帶走熱量，調節堆體溫度。微生物在生長繁殖過程中分解和利用殘存蛋白質、糖、氨基酸、無機鹽和其它有機物時放出熱量使堆體溫度升高含水量減少，堆體重量減少，環孢菌素殘留減少。空白對照組具體指標見表1，試驗組見表2。

從表1可知，處理過程中，由于只有環境微生物作用，生產過程漫長，堆心最高溫度為62.6℃。菌渣經過45d自然堆肥，環孢菌素菌渣減量40%以上，廢渣中環孢菌素殘留為300mg/L以上。

從表2可知，環孢菌素菌渣經過厭氧芽孢桿菌堆肥處理，第2天溫度達到接近50℃，第7天溫度開始降低，說明該菌生長代謝開始減速。第8天接種嗜熱地芽孢桿菌，堆體迅速升溫，到第13天生長代謝開始減速。第14天接種極端嗜熱菌，堆心溫度最高到達105.6℃。在整個過程中，從第2天起，菌渣中的主要菌群已變為接種菌株，優勢菌群依次為：1#、 2#和3#，表明菌渣的減量變化因這3種菌的活動引起的。

表1 試驗組堆肥過程各指標變化情況Tab. 1 The course of batch culture (n=5)

表2 試驗組堆肥過程各指標變化情況Tab. 2 The course of batch culture (n=5)

經過3周的新工藝處理，環孢菌素菌渣減量80%以上，廢渣中環孢菌素殘留去除率近99%。經過處理的菌渣，環孢菌素A的殘留低于10mg/L，進入環境后，環孢菌素A的殘留遠低于其作用微生物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)(256～512mg/L)[8]，已較難以引起耐藥性的產生，且環孢菌素A通常情況不作為抗生素使用，因而已不具有環境危害性。

2.2 總氮、總磷和總鉀的變化

堆肥產熱本質上是微生物新陳代謝的過程，有機物在此過程中被不斷分解，并以NH3、H2O、CO2等形式揮發損失，造成氮元素和碳元素絕對量及總干物質質量逐漸減少，并且碳的消耗速率快于氮源的消耗，堆肥結束時，物料中的磷鉀等養分相對含量高于原始物料，含水率逐步下降[6]。在本試驗中引入了超高溫菌，大部分氮源也被水解以NH3的形式揮發，因此在整個處理過程中，物料的C/N呈現一個先下降后回升的過程，見圖1。這是因為中溫菌菌消耗有機物，使碳源消耗以二氧化碳的形式釋放，物料的C/N下降；后期菌渣在超高溫菌的作用下，菌渣溫度進一步升高，使得NH3揮發，物料的C/N下降。最后的剩余的物料絕大部分碳源和氮源被消耗，殘留物主要為磷鉀等成分。

3 結論

圖1 堆肥過程中C/N的變化Fig. 1 The change of C/N in the composting process

環孢菌素菌渣依次經過厭氧芽孢桿菌堆肥處理5～8d，嗜熱地芽孢桿菌堆肥處理4～7d和極端嗜熱菌堆肥處理4～6d，環孢菌素菌渣減量80%以上，廢渣中環孢菌素殘留去除率近99%。常用的堆肥處理菌渣方式是多菌混合處理，弊端在于每種菌體需要的生長溫度不一樣，而且存在相互抑制的現象，并且周期達到40d，藥物殘留高。本工藝分階段補入不同細菌，生長溫度逐步提高，每種菌都能夠最大限度發揮其生理功能，前一步菌體死亡后又成為下一步菌的營養。最后加入超高溫嗜熱菌(Calditerricola yamamurae)使得堆肥溫度達到100℃以上，消耗有機質的同時又使絕大部分NH3得以釋放。由于雷帕霉素、他克莫司、霉酚酸和咪唑立賓等菌渣性質與環孢菌素A菌渣類似，可以研究將本工藝用于這些菌渣的無害化和減量化處理。

在早期，抗生素菌渣一直被作為工業廢棄物而丟棄。為了有效利用抗生素菌渣，從20世紀50年代以來，抗生素菌渣被廣泛用作動物蛋白飼料和飼料藥用添加劑。但是其中殘留的抗生素會在動物體內富集，并通過泌乳、產蛋而進入奶、蛋中，進而對人類產生毒、副作用，使人體內的致病菌產生抗藥性。2002年2月，農業部、衛生部、國家食品藥品監督管理局發布176號公告，禁止抗生素菌渣在飼料和動物飲用水中使用[7]，大部分抗生素生產廠無力處理生產過程產生的大量菌渣，以每噸數千元的代價交由第三方處理。采用三聯菌處理環孢菌素菌渣，實現了無害化和減量化，廢渣中環孢菌素殘留基本去除，經處理后的殘渣含有豐富的磷鉀等成分，且沒有其它危險廢物特性，可進一步探討用于生產有機肥，具備較好的環境效益和社會效益。